本发明专利技术提供一种预防和治疗猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗及其制备方法，所述多价灭活疫苗包含灭活的支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌A型和多杀性巴氏杆菌D型及PMT类毒素。本发明专利技术还提供了一种新的PMT培养和提取的方法，因此，本发明专利技术的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗抗原保护全面，相对于传统的猪萎缩性鼻炎疫苗而言，可以更全面并且更加有效地治疗和预防猪萎缩性鼻炎。最后，本发明专利技术的多价疫苗中，各种抗原的配比合理的疫苗，可以解决各种抗原相互干扰的问题，进而提高免疫的效果。而且，发明专利技术人还提供了一种水型佐剂，可以解决传统的铝胶佐剂、弗氏佐剂、油包水型佐剂注射后吸收不完全，副反应大等缺点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种预防和治疗猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，特别是指一种含多种抗原的猪萎缩性鼻炎的水性佐剂灭活疫苗。
技术介绍
猪萎缩性鼻炎(atrophic rhinitis，AR)是猪群的一种重要的呼吸系统传染病，它会引起猪的慢性鼻炎、打喷嚏、流眼泪、颜部变性和鼻甲骨萎缩等症状，严重的还可以导致鼻吻变形并影响全身骨骼发育，从而导致猪生长迟缓，使猪容易感染继发性复合性肺炎，给养猪业造成巨大的损失。该病可感染任何年龄阶段的猪，其中4周龄以内的猪感染率最高， 症状一般出现在8-12周龄。猪萎缩性鼻炎可分为进行性猪萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis, PAR)和非进行性猪萎缩性鼻炎(nonprogressive atrophic rhinitis，NPAR)。进行性猪萎缩性鼻炎主要由产毒素多杀性巴氏杆菌(toxigenic Pasteurella multocida, Pm) 引起，是猪萎缩性鼻炎的主要形式；非进行性猪萎缩性鼻炎，单纯由支气管败血波氏杆菌 (Bordetella bronchiseptica, Bb)引起，由于其通常只引起轻微的鼻甲骨萎缩，往往观察不到鼻吻部的典型病变，而常常为人们所忽视。产毒素多杀性巴氏杆菌(Pm)有荚膜D型和A型等。D型和A型Rn均可以分泌一种皮肤坏死毒素(Pasteurella multocida toxin, PMT) 由于D型Pm与A型Pm产生的PMT 均相同，因此，现有的疫苗中常常仅含有D型Rii抗原，不含A型Rii。PMT是约146KDa的类毒素(toxoid)，可直接引起猪鼻炎、鼻梁变形、鼻甲骨萎缩甚至消失，全身代谢障碍，生产性能下降，是猪萎缩性鼻炎最重要的致病因子。PMT在去离子水(DW)中，或在高于pHIO或低于pH4的溶液中，都不稳定。因此，传统中用于预防猪萎缩性鼻炎的疫苗抗原是利用福尔马林(formaldehyde)灭活，以使PMT成为失去毒性但保有抗原性的类毒素(toxoid)。但是，生产PMT类毒素的步骤复杂，现有技术中是先于37°C下以血液培养基来培养多杀巴斯德氏菌产毒株Rn长达沈小时，或是以脑心浸出物肉汤培养基 (brain heart infusionbroth, BHI brotti)培养72小时后，进行PMT的提取与浓缩，所收获的毒素于37°C下以福尔马林灭活4天后，才能得到低毒性但仍具抗原性的类毒素。因此，除了制备方式繁琐以外，将PMT灭活制备成疫苗中抗原成本很高，也限制了 PMT在猪萎缩性鼻炎中的应用。当前，我国所用的猪萎缩性鼻炎疫苗还主要是支气管败血波氏杆菌(Bb)灭活苗或支气管败血波氏杆菌(Bb)加有产毒素多杀性巴氏杆菌D型(Pm-D)的灭活苗，所使用的佐剂常常为铝胶佐剂、弗氏佐剂、油包水型佐剂，存在着保护性抗原成分少，不能提供完全的保护，注射后吸收不完全，副反应大等缺点。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提供一种预防和治疗猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，包含灭活的支气管败血波氏杆菌(Bb)，灭活的多杀性巴氏杆菌A型(Pm-A)，灭活的多杀性巴氏杆菌D型(Pm-D)和灭活的多杀性巴氏杆菌D型的类毒素(PMT)及兽药学上可接受的佐剂。优选地，本专利技术的灭活的多杀性巴氏杆菌D型的类毒素为使用甲醛灭活获得的类毒素。优选地，本专利技术的支气管败血波氏杆菌HN8株保藏号为CCTCC NO :M2011223，多杀性巴氏杆菌A型HN5株保藏号为CCTCC NO :M2011222，多杀性巴氏杆菌D型HB4株保藏号为 CCTCC NO :M2011221o优选地，本专利技术的支气管败血波氏杆菌含量为IXlO9 5X109CFU/ml。优选地，本专利技术的多杀性巴氏杆菌A型含量为IXlO9 5X109CFU/ml。优选地，本专利技术的多杀性巴氏杆菌D型含量为IXlO9 5X109CFU/ml。优选地，本专利技术的多杀性巴氏杆菌D型的类毒素含量为1 5yg/ml。优选地，本专利技术的兽药学上可接受的佐剂为水佐剂。优选地，本专利技术的兽药学上可接受的佐剂为gel佐剂。本专利技术的另一目的在于提供一种猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)将保存的支气管败血波氏杆菌HN8株菌种于固体平面活化，挑取单克隆于适宜培养基培养16-24h，之后于适宜培养基扩大培养16-24h，收获菌液，灭活；(2)将保存的多杀性巴氏杆菌A型HN5株，多杀性巴氏杆菌D型菌HB4株种于固体平面活化，挑取单克隆于适宜培养基培养16-24h，之后于适宜培养基扩大培养16-24h，收获菌液，灭活；(3)多杀性巴氏杆菌D型菌HB4株种于固体平面活化，挑取单克隆于适宜培养基培养16-24h，之后于适宜培养基扩大培养16-24h，收获菌液，离心收集菌体，超声破碎，提取多杀性巴氏杆菌D型(PMT)毒素，甲醛灭活制成PMT类毒素；(4)将已灭活的支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌A型、多杀性巴氏杆菌D型和PMT类毒素按比例混合，加入水佐剂，乳化制成多价灭活疫苗。优选地，本专利技术的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗的制备方法，已灭活的支气管败血波氏杆菌的含量为IXlO9 5X109CFU/ml、多杀性巴氏杆菌A型的含量为IXlO9 5X 109CFU/ml、多杀性巴氏杆菌D型的含量为1 X IO9 5X 109CFU/ml和PMT类毒素的含量为 1 5 μ g/ml0技术效果由上可知，本专利技术的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗有如下优点首先，本专利技术的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗的抗原保护全面，相对于传统的猪萎缩性鼻炎疫苗而言，不仅有常见的灭活的多杀性巴氏杆菌D型(Pm-D)抗原和灭活的支气管败血波氏杆菌(Bb)抗原，还含有灭活的多杀性巴氏杆菌A型(Pm-A)抗原和PMT类毒素， 因此本专利技术的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗可以更全面并且更加有效地治疗和预防猪萎缩性鼻炎，特别是针对由多杀性巴氏杆菌A型或PMT直接引起的猪萎缩性鼻炎提供更加有效的疫苗，而在以往对猪萎缩性鼻炎中的防治中常常被人们所忽视。其次，本专利技术提供了一种新的PMT培养和提取的方法，克服了以往灭活PMT类毒素需要使用福尔马林，而可能使该毒素的抗原性产生一些无法预估的化学结构性变化，进而影响到疫苗的效力的缺点。并且，本专利技术的培养PMT的工艺简便，具有生产时间短、效率高、 生产成本低廉、无毒性、高安全性及高免疫保护效力特点，因此，本专利技术的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗可以含有传统疫苗中没有的灭活的PMT类毒素的抗原。 最后，本专利技术的猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗经过专利技术人反复试验获得了一种各种抗原的配比合理的疫苗，可以解决各种抗原相互干扰的问题，进而提高免疫的效果。而且，专利技术人还提供了一种水型佐剂，可以解决传统的铝胶佐剂、弗氏佐剂、油包水型佐剂注射后吸收不完全，副反应大等缺点。附图说明图1为PCR鉴定结果图。菌株保藏信息本专利技术菌株为支气管败血波氏杆菌HN8株(Bordetella bronchiseptica HN8)保藏号为 CCTCC NO :M2011223，多杀性巴氏杆菌 A 型 HN5 株(Pasteurella multocida A Type HN5)保藏号为 CCTCC NO :M2011222、多杀性巴氏杆菌 D 型本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种预防和治疗猪萎缩性鼻炎的多价灭活疫苗，其特征在于，包含灭活的支气管败血波氏杆菌，灭活的多杀性巴氏杆菌Ａ型，灭活的多杀性巴氏杆菌Ｄ型和灭活的多杀性巴氏杆菌Ｄ型的类毒素及兽药学上可接受的佐剂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张许科，孙进忠，白朝勇，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：41
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