本发明专利技术与动物疫病分子生物学检测领域有关，具体涉及一种用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测支气管败血波氏杆菌的检测试剂盒及其方法。本发明专利技术根据NCBI中Genbank数据库中发布的支气管败血波氏杆菌序列，经过序列比对，采用LAMP引物设计软件设计引物，运用环介导等温扩增技术进行支气管败血波氏杆菌的检测，具有快速、灵敏度高、特异性强、成本低等特点，可广泛应用于临床的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽用生物制品领域中的疾病诊断技术，具体涉及一种。
技术介绍
支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica, Bb)是寄生在呼吸道黏膜纤毛上皮细胞的一种革兰氏阴性小球杆菌，可广泛感染包括猪、犬等在内的多种哺乳动物， 使呼吸道产生不显性感染及急、慢性炎症，引起诸如犬传染性支气管炎、兔传染性鼻炎等疾病，也是猪传染性萎缩性鼻炎的病原之一，人也有感染该菌的报道，尤其是小孩和免疫力缺陷的人群。支气管败血波氏杆菌于1910年由Ferry首次从患有犬瘟热的犬呼吸道中分离出来，经历四次更名，最后Moreno—Lopez才将支气管败血波氏杆菌划为波氏杆菌属。目前，波氏杆菌属分为七个种，其中将百日咳波氏杆菌(B. pertussis)，副百日咳波氏杆菌 (B. parapertussis)和支气管败血波氏杆菌列为一群,而将包括禽波氏杆菌(B. avium)在内的其余四种归为另一群。对于养猪业来讲，支气管败血波氏杆菌易与产毒素多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)混合感染，产生进行性萎缩性鼻炎，其主要表现为鼻塞、打喷嚏、流鼻血、咳嗽、呼吸不畅、颜面变形或鼻梁歪斜、生长缓慢，哺乳仔猪感染本病后，除引起鼻 甲骨萎缩或消失外，还可以引起全身钙代谢障碍，致使仔猪发育迟缓，饲料利用率降低，有时伴发急、慢性支气管炎，导致仔猪死亡，给养殖业带来严重的经济损失。实验室通常的诊断方法是用聚合酶链式反应(PCR)，该方法虽然灵敏、特异，但是成本较高且需要专门的PCR仪，而且到目前为止，尚无有效的检测试剂盒问世，因此研制支气管败血波氏杆菌检测试剂盒能对该病进行快速诊断，对临床治疗和疾病控制有巨大的意义。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是由 T. Notomi于2000年专利技术的一种新型核酸扩增技术，该技术针对待测靶基因序列的6个区域设计一套两对特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在65°C左右等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸扩增，由于其扩增依赖于目的序列的四个特异性区域，因此其特异性和敏感性均较普通PCR和荧光定量PCR高，而且由于该反应在恒温条件下进行，因此不需要昂贵的仪器，而使用普通的水浴锅即能进行扩增反应，另外扩增反应可以在一个小时之内完成，所需时间短，且其反应产物易于观察，扩增结果可直接通过对扩增副产物焦磷酸镁沉淀进行肉眼观察判断。基于以上优点，LAMP从专利技术之日起，已被广泛用于病原的检测，如大肠杆菌、猪传染性胸膜肺炎、沙门氏菌、结核杆菌、禽流感、疱疹病毒等细菌性疾病和病毒性疾病的检测，但是到目前为止，未发现运用LAMP方法检测支气管败血波氏杆菌的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测支气管败血波氏杆菌的LAMP试剂盒并提供一种。一种用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒，该试剂盒包括环介导等温扩增反应液，23 μ L/份，其组成如下I μ L浓度为8U的BstDNA聚合酶，2. 5 μ L的聚合酶缓冲液，浓度为5 μ mo I/L的上游内引物FIP和下游内引物BIP各I μ L，浓度为25 μ mol/L的上游外引物F3和下游外弓I物 B3各I μ L，2 μ L浓度为IOOmM的MgSO4, 5 μ L浓度为IOmM的dNTP，5 μ L浓度为5Μ的甜菜碱,3. 5 μ L的无菌水；其中聚合酶缓冲液含有200mM Tris-HCl (ρΗ8· 8)，IOOmM KCl, IOOmM(NH4)2SO4, 20mM 的 MgSO4,1 % Triton X-100 ；所述的引物序列为上游外引物F3 CCTTTGCCGCCAGATTCC下游外引物B3 GCTCCCAAGAGAGAAAGGC上游内引物FIP TGGATTACGGCAGGTTTGCGA-CCCGCACATTTCCGAACT下游内引物BIP GGCAACAAAGGAAATCGCGGC-TCTTCAAACCGGGCAGCT使用所述试剂盒检测支气管败血波氏杆菌的方法，包括以下步骤(I)波氏杆菌DNA的提取I)、取ImL细菌过夜培养液,5000rpm离心IOmin,去上清；2)、加550 μ L的TE溶液悬浮沉淀，并加50 μ L10% SDS溶液，50 μ L20mg/mL蛋白酶K，混匀，37°C保温Ih ；3)、加 150 μ L5mmol/L 的 NaCl 溶液，混匀加 150 μ L CTAB/NaCl 溶液，混匀，65°C保温 20min ；4)、用等体积酹氯仿异戍醇(三者体积比25 24 I)抽提,5000rpm离心 lOmin，将上清液移至干净离心管中，用等体积酚氯仿(体积比24 I)抽提，取上清液移至干净试管中； 5)、加I倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止lOmin，沉淀DNA ；6)、用70 %乙醇漂洗沉淀后，洗干，溶解于100 μ L的TE溶液，-20°C保存，作为模版备用。(2)进行支气管败血波氏杆菌的环介导等温扩增在装有23 μ L的LAMP反应试剂的反应管中加入2 μ L待检DNA，与65°C恒温水浴锅中放置I个小时，后将水浴锅调至80°C反应5min来终止反应。(3)结果的观察反应完毕后取出PCR管，12000转/分离心I分钟，然后观察PCR反应管底部有无白色沉淀，如有沉淀产生则判定为阳性。本专利技术针对支气管败血波氏杆菌的鞭毛基因(flagellum gene)的高度保守序列建立了 LAMP技术，特异性强、灵敏度高，解决了现有技术中检测支气管败血波氏杆菌面临的所需周期长、成本高、灵敏度较低等问题，检测过程中无需昂贵的仪器，仅需水浴锅而已， 检测结果易于判别，而且扩增完成后可以在不开盖的情况下判定结果，避免了扩增产物对后续检测的污染，与其它的检测方法相比具有明显的优势，可广泛应用于临床的检测。附图说明图I为试剂盒扩增后结果，图中“ + ”为阳性扩增结果，为阴性扩增结果。图2为敏感性实验电泳结果，图中M为DNA分子量标准，I 8分别为100 107 倍稀释度扩增结果。图3为特异性检测结果，图中M为DNA分子量标准，I 7分别为支气管败血波氏杆菌、百门咳波氏杆菌、副百日咳波氏杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。实施例I支气管败血波氏杆菌LAMP引物设计与筛选登录NCBI网站 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/,查找 Genbank 公布的支气管败血波氏杆菌鞭毛基因(flagellum gene)的序列，运用DNAstar、Blast进行序列比对后找出高度保守的序列，如下 TGGCGCCTGC CCTATCCCGT CCGCGCCGCA CGGACGCCTG TCCCCGCAGG AACATGCCCT TTGCCGCCAGATTCCCCCGC ACATTTCCGA ACTTCACTTT TTTTGCTTAA GTCCGTCGCA AACCTGCCGT AATCCAGGCAACAAAGGAAA TCGCGGCGCT GTGCAAGCGA AAG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：环介导等温扩增反应液，23μL/份，其组成如下：1μL浓度为8U的BstDNA聚合酶，2.5μL的聚合酶缓冲液，浓度为5μmol/L的上游内引物FIP和下游内引物BIP各1μL，浓度为25μmol/L的上游外引物F3和下游外引物B3各1μL，2μL浓度为100mM的MgSO4，5μL浓度为10mM的dNTP，5μL浓度为5M的甜菜碱，3.5μL的无菌水；其中聚合酶缓冲液含有200mM？Tris？HCl(pH8.8)，100mM？KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM的MgSO4，1％Triton？X？100；所述的引物序列为：上游外引物F3：CCTTTGCCGCCAGATTCC下游外引物B3：GCTCCCAAGAGAGAAAGGC上游内引物FIP：TGGATTACGGCAGGTTTGCGA？CCCGCACATTTCCGAACT下游内引物BIP：GGCAACAAAGGAAATCGCGGC？TCTTCAAACCGGGCAGCT。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐志文，朱玲，张辉，杨宏伟，周远成，
申请(专利权)人：四川农业大学，四川太平洋生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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