一种用于扩增球孢白僵菌的特异性引物，它涉及一对用于扩增球孢白僵菌的特异性引物。本发明专利技术解决了目前缺乏引物从土壤样品DNA中扩增出球孢白僵菌靶标序列的问题。本发明专利技术用于扩增球孢白僵菌的特异性引物为qBeaF(5’-TCAACTCCCTAACCCTTC-3’)和qBeaR(5’-GCTGGAATACAAGAGTTTGA-3’)。本发明专利技术的引物能够准确扩增出球孢白僵菌目的片段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于扩增球孢白僵菌的特异性引物，可用于对土壤样品中球孢白僵菌的分子检测。
技术介绍
球抱白僵菌(Beauveria bassiana Vuillemin)属半知菌纲丛梗抱目丛梗抱科白 僵菌属，是最常见的昆虫病原真菌之一，寄主范围广、致病力强，对人、畜、林木作物无毒害，不伤害天敌，不污染环境，已被成功开发成多种商品制剂用于农林害虫的生物防治。目前，我国是生产和应用白僵菌杀虫剂的第一大国，每年施用面积约50万hm2，球孢白僵菌已在南方大面积用于防治林区松毛虫，并且在东北地区防治玉米螟取得了显著效果。球孢白僵菌的防效与其田间土壤中的存活有很大关系，对土壤中球孢白僵菌的研究，传统方法依赖选择性培养基分离培养或大蜡螟诱集法，但是这两种方法耗时费力。随着分子生物学的飞速发展，基于PCR的分子检测技术已在农业微生物研究中应用越来越普遍。利用PCR检测技术对土壤中球孢白僵菌进行种类、数量和分布的研究将极大地促进该虫生真菌在害虫综合防治体系中的应用。
技术实现思路
本专利技术是为了解决目前缺乏引物从土壤样品DNA中扩增出球孢白僵菌靶标序列的问题，而提供一种用于扩增球孢白僵菌的特异性引物。本专利技术用于扩增球孢白僵菌的特异性引物为正向引物5，-TCAACTCCCTAACCCTTC-3 ’和反向引物 5 ’ -GCTGGAATACAAGAGTTTGA-3 ’。将本专利技术所用引物对命名为qBeaF/BeaR。本专利技术的引物是根据真菌核糖体rDNA的序列碱基存在差异的特点而设计的。应用本专利技术的引物BeaF/BeaR可从各类样品DNA中直接扩增出长度为115bp的球孢白僵菌目的片段。附图说明图I为实施例I中qBeaF/BeaR弓丨物对6种属真菌DNA扩增产物的凝胶电泳图。图2为实施例2中qBeaF/BeaR弓丨物对土壤样品DNA扩增产物的凝胶电泳图。具体实施例方式实施例I分别以球抱白僵菌(Beauveria bassiana)、布氏白僵菌(Beauveriabrongniartii)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、玫烟拟青霉(Paecilomycesfumosoroseus)、腊阶轮枝菌(Verticillium Iecanii)、尖键抱菌(Fusarium oxysporum)和链格孢菌(Alternaria alternata) 6个属真菌DNA为模板进行引物BeaF/BeaR的特异性验证试验。 PCR扩增体系为25 μ L由O. 5 μ L DNA模板(约IOng)、0. 5 μ L正向引物qBeaF(lOyM)、0· 5 μ L反向引物 qBeaR(10 μ Μ)、0· 5μ L dNTPs (10mmol/L)、2· 5μ L IOXPCRbuffer (with MgC12) ,0. 2μ I TaqDNA 聚合酶(5U/μ L)，灭菌双蒸水补足 25 μ L。PCR 扩增反应条件为预变性94°C 3min,变性94°C 30s,退火55°C 30s,延伸72°C 30s，共35个循环，72°C 延伸 5min，4°C 保存。将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图I所示，图I中M泳道为标准BM2000，I号泳道为不含DNA空白对照的扩增结果，2-8号泳道分别为含有球抱白僵菌(Beauveria bassiana)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、玫烟拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)、腊阶轮枝菌(Verticillium Iecanii)、尖键抱菌(Fusarium oxysporum)和链格抱菌(Alternariaalternata)DNA的扩增结果。从图I中可以看出本实施方式用于扩增球孢白僵菌的特异性引物BeaF/BeaR能够准确的扩增出球孢白僵菌的靶标序列片段，而未能从近缘真菌DNA和空白对照中扩增出核酸片段。将2号泳道对应的序列片段与T载体连接后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞测序，测序结果为序列长度为115bp，并且经blast分析，为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的特异序列。实施例2应用引物qBeaF/BeaR对6份土样(采自河北廊坊市)DNA进行PCR扩增试验。PCR扩增体系为25yL 由 0.5yL DNA 模板(约 IOng)、0· 5 μ L 正向引物 BeaF(10 μ Μ)、0· 5 μ L反向引物 BeaR(10yM)、0.5yL dNTPs (10mmol/L)、2· 5 μ L 10XPCR buffer (with MgCl2)、0. 2μ I TaqDNA聚合酶(5U/μ L)，灭菌双蒸水补足25 μ L。PCR扩增反应条件为预变性940C 3min，变性 94°C 30s，退火 55°C 30s，延伸 72°C 30s，共 35 个循环，72°C延伸 5min，4°C保存。将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，图2中M泳道为标准BM2000，16号泳道分别为河北廊坊市土壤样品DNA的扩增结果，7号泳道为不含DNA空白对照的扩增结果。从图2中可以看出本实施方式用于扩增球孢白僵菌的特异性引物BeaF/BeaR能够准确的从所有土壤样品DNA中扩增出球孢白僵菌的靶标序列片段。随机挑选I和4号泳道对应的序列片段分别与T载体连接后转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞测序，测序结果为序列长度为115bp,并且经blast分析,为球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的特异序列。权利要求1.一种用于扩增球孢白僵菌的特异性引物，其特征在于用于扩增球孢白僵菌的特异性引物为 正向引物 qBeaF :5’ -TCAACTCCCTAACCCTTC-3’ 反向引物 qBeaR :5’ -GCTGGAATACAAGAGTTTGA-3’全文摘要一种用于扩增球孢白僵菌的特异性引物，它涉及一对用于扩增球孢白僵菌的特异性引物。本专利技术解决了目前缺乏引物从土壤样品DNA中扩增出球孢白僵菌靶标序列的问题。本专利技术用于扩增球孢白僵菌的特异性引物为qBeaF(5’-TCAACTCCCTAACCCTTC-3’)和qBeaR(5’-GCTGGAATACAAGAGTTTGA-3’)。本专利技术的引物能够准确扩增出球孢白僵菌目的片段。文档编号C12Q1/68GK102925539SQ20111022677公开日2013年2月13日 申请日期2011年8月9日 优先权日2011年8月9日专利技术者谢明, 张艳军 申请人:谢明本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于扩增球孢白僵菌的特异性引物，其特征在于用于扩增球孢白僵菌的特异性引物为：正向引物qBeaF：5’？TCAACTCCCTAACCCTTC？3’反向引物qBeaR：5’？GCTGGAATACAAGAGTTTGA？3’
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢明，张艳军，
申请(专利权)人：谢明，
类型：发明
国别省市：
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