一种用于白僵菌群落结构DGGE分析的引物，它涉及一对用于白僵菌群落结构分析的DGGE引物。本发明专利技术解决了目前缺乏引物用于白僵菌群落结构DGGE分析的问题。本发明专利技术用于白僵菌群落结构DGGE分析的引物为：正向引物dBeaF(5’-TAACCCTTCTGTGAACCTACCTATC-3’)和反向引物dBeaR-gc(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCGCCACTCCATTTCAG-3’)。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于白僵菌群落结构分析的DGGE引物，可用于白僵菌群落结构的DGGE鉴定分析。
技术介绍
白僵菌(Beauveria)属半知菌纲丛梗孢目丛梗孢科，是自然界广泛存在的一类真菌，其中包含非常优良的昆虫病原真菌，如球孢白僵菌(Beauveria bassiana Vuillemin)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)等，已被成功开发成多种商品制剂用于农林害虫的生物防治。我国是生产和应用白僵菌杀虫剂的第一大国，每年施用面积约50万hm2，白僵菌已在南方大面积用于防治林区松毛虫，并且在东北地区防治玉米螟取得了显著效果。白僵 菌的防效与其在田间土壤中的存活和优良菌株在白僵菌群落中所占的比例有很大关系，对土壤中白僵菌的研究，传统方法依赖于选择性培养基分离培养或大蜡螟诱集法，这两种方法耗时又费力。基于PCR的分子检测技术可对土壤中白僵菌的种类、数量和分布进行研究，却无法对白僵菌群落结构进行解析。变性梯度电泳(DGGE)技术由Fischer和Lerman于1979年最先提出，是用于检测DNA突变的一种电泳技术。Myers于1985年首次在DGGE中使用GC发夹技术，可防治DNA片段在DGGE胶中完全解链，DNA片段中每个碱基处的序列差异基本都能被区分开，使DGGE技术日臻完善。与传统的微生物研究方法相比，DGGE的一大优点是能够快速、准确的鉴定各种样品中微生物群落结构演替规律和种群动态，无需对所研究的微生物进行纯种培养。DGGE的另一优点是能够同时对比分析大量的样品，既可比对分析不同微生物群落间的差异，也可研究同一微生物群落随时间和外部环境压力的变化过程。因此，DGGE技术已成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具。
技术实现思路
本专利技术是为了解决目前缺乏引物用于白僵菌群落结构DGGE分析的问题，而提供一种用于白僵菌群落结构DGGE分析的引物。本专利技术用于白僵菌群落结构DGGE分析的引物为正向引物dBeaF(5’-TAACCCTTCTGTGAACCTACCTATC-3，)和反向引物 dBeaR-gc (5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCGCCACTCCATTTCAG-3，)。本专利技术的引物是根据白僵菌属真菌核糖体rDNA的序列碱基存在差异的特点而设计的。应用本专利技术的引物dBeaF/R-gc可扩增出长度为378bp的目的片段，通过DGGE分析PCR扩增产物可提供样品中白僵菌群落结构的信息。附图说明图I为采用引物dBeaF/R-gc对样品的PCR扩增产物的琼脂糖电泳图谱。M泳道为BM2000,1-3号泳道为样品PCR扩增产物，4号泳道为空白对照。图2为图I中PCR扩增产物的DGGE电泳图谱。具体实施例方式土壤样品DNA提取称取5g土壤样品和Ig玻璃珠至50mL离心管，加入13. 5mL DNA提取液(O. ImoI/L Tris base,O. lmol/L EDTA，0. lmol/L磷酸钠，I. 5mol/L NaCl, 1%CTAB,ρΗ8· 0)混合，加入 100 μ L 蛋白酶 K(10mg/mL)，置摇床，225r/min，37。。摇 30min ;加入 I. 5mLSDS (20% )，置水浴锅，65°C水浴2h，每隔15 30min缓慢颠倒离心管数次；取出后室温，3000rpm离心5min,收集上清液至新的50mL离心管；土壤样品沉淀继续加4. 5mL DNA提取液和O. 5mL SDS (20%),涡旋10s，置水浴锅，65°C水浴lOmin，收上清液，与前一次上清液合并，重复上述操作，收集上清液与前两次上清合并；上清液加入等体积氯仿-异戊醇(体积比为24 : I), 12000rpm离心5min ;将水相转至5OmL离心管,加入O. 6倍体积的异丙醇，室温沉淀Ih,室温16000rpm离心20min ;收核酸沉淀,加入70%乙醇(冷)，洗漆沉淀两次，重悬于TE缓冲液，最终体积500 μ L0 样品DNA中18S-ITS1-5. 8S-ITS2-28S rDNA部分片段的PCR扩增使用引物对为dBeaF(5，-TAACCCTTCTGTGAACCTACCTATC-3，)和 dBeaR-gc(5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCGCCACTCCATTTCAG-3’)对样品中的 18S-ITS1-5. 8S-ITS2-28S rDNA 部分片段进行PCR扩增。PCR扩增体系为25 μ L由O. 5 μ L DNA模板(约IOng)、0. 5 μ L正向引物 dBeaF(lOyM)、0· 5μ L 反向引物 dBeaR-gc (10 μ Μ)、0· 5μ L dNTPs (I Ommo I/L)、2· 5μ L10XPCR buffer (带 MgCl2)、O. 2 μ ITaqDNA 聚合酶(5U/μ L)，灭菌双蒸水补足 25 μ L。PCR扩增反应条件为预变性940C 3min，变性94°C 30s，退火59. 5°C 30s，延伸72°C 45s，共35个循环，72°C延伸5min，4°C保存。PCR扩增产物见图I。PCR扩增产物的DGGE分析丙烯酰胺凝胶浓度为8 %，变性梯度为50_70 % (由7mol/L尿素和质量浓度40%去离子甲酰胺组成的水溶液作为100%变性剂)，PCR产物上样量为200ng。DGGE电泳条件为电压80V，60°C下电泳12h。电泳完毕后用I X SYBR-Green染色30min，通过Bio-rad凝胶成像系统观察结果。PCR扩增产物的DGGE见图2。DGGE凝胶中相关条带回收、克隆和测序用灭菌刀片将相关条带切下，放入I. 5mL灭菌离心管，捣碎，加入60 μ L无菌水去离子水清洗，后加入60 μ L无菌水去离子于4°C静置过夜。取上清液2 μ L做DNA模板进行PCR扩增。PCR扩增产物与T载体连接后转化入大肠杆菌感受态细胞，并进行蓝白斑挑选。选择样品基因组的PCR产物作为参照，DGGE比对阳性克隆子PCR产物的相对位置，淘汰假阳性克隆子。阳性克隆子送上海生工测序，测序后登录Genbank进行序列比对。权利要求1. 一种用于白僵菌群落结构分析的DGGE引物，其特征在于用于白僵菌群落结构分析的DGGE引物为正向引物 dBeaF :5’ -TAACCCTTCTGTGAACCTACCTATC-3’反向引物 dBeaR-gc :5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCGCCACTCCATTTCAG-3，。全文摘要一种用于白僵菌群落结构DGGE分析的引物，它涉及一对用于白僵菌群落结构分析的DGGE引物。本专利技术解决了目前缺乏引物用于白僵菌群落结构DGGE分析的问题。本专利技术用于白僵菌群落结构DGGE分析的引物为正向引物dBeaF(5’-TAACCCTTCTGTGAACCTACCTATC-3’)和反向引物dBeaR-gc(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCGCCACTCCATTTCAG-3’)。文档编号C12R1/645GK本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于白僵菌群落结构分析的DGGE引物，其特征在于用于白僵菌群落结构分析的DGGE引物为：正向引物dBeaF：5’？TAACCCTTCTGTGAACCTACCTATC？3’反向引物dBeaR？gc：5’？CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCGCCACTCCATTTCAG？3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张艳军，谢明，
申请(专利权)人：张艳军，
类型：发明
国别省市：
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