一种分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的方法，属于微生物生态技术领域。本发明专利技术用巢式聚合酶链式反应结合变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）的方法半定量分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的多样性。采用珠磨法提取大曲或酒醅样品中总基因组DNA，巢式PCR两步扩增Bacillus特异性片段，DGGE电泳分析，利用标准菌株确定DNA条带相应的微生物种属，未知条带切胶回收后重新PCR、连接T载体并克隆、再次DGGE电泳，阳性克隆测序并在GenBank数据库中blast比对获取微生物信息，最后利用quantityone软件数字化处理DGGE图谱，根据条带亮度计算出不同Bacillus菌种在总Bacillus菌群中的比例。本发明专利技术具有简便、特异性强、重复性好的优点，为进一步探究Bacillus在白酒生产中的重要作用奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
一种分析白酒发酵体系中群落结构的方法，本专利技术涉及使用现代分子生物学技术一聚合酶链式反应-变形梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)克服传统微生物分离方法的缺陷，定性并半定量分析中国白酒群体微生物的发酵体系中群体的结构组成及其动态演变规律，属于微生物生态
技术介绍
中国白酒生产是一个开放的固态发酵过程，可以说白酒的生产实际上包含了一个庞大的微生物区系的复杂代谢过程，受环境的影响较大。随着环境条件的改变，微生物区系也会发生改变，并对白酒的风味口感产生影响。大曲和酒醅是白酒生产中重要的微生物载体，其中是主要的细菌。卞應分Bacillus属的菌种都能合成淀粉酶、蛋白酶,且对白酒生产中的不利环境条件具有较高的抵抗力，自始至终存在于白酒酿造过程中。因此，Bacillus是白酒发酵体系中重要的产酶菌和生香细菌，Bacillus群体的结构成为中国白酒研究的热点。目前国内学者主要通过筛选、培养方法来分离、分析白酒发酵体系中的Bacillus。从白酒发酵体系中分离得到的BaciIlus主要有枯草芽孢杆菌iBaciIus sub ti7i5·)、环状芽抱杆菌iBaciIlus circulans )、巨大芽抱杆菌iBaciIlus maga teri )、腊状芽抱杆菌iBaciIlus cereus)、地衣芽抱杆菌QBaciIlus Iicheniformis)和解淀粉芽抱杆菌QBaci Ilus amyloli quefaci ens )等。有研究学者发现在酱香型白酒发酵过程中，某些B.Iicheniformis是产生酱香风味的重要功能微生物,还发现某些是酱香型高温大曲中生成酸性蛋白酶的主要菌种。而汉在大曲细菌中数量较多，是形成酒体芳香类物质的重要菌源。白酒酿造体系中形成了特殊结构和特殊功能的群体。但传统的微生物研究方法具有较大的局限性，存在操作繁琐，菌落形态、生化特性相像导致难以准确鉴定，结果准确性及可靠性差，易遗漏某些培养条件苛刻的菌种等缺点。近年来，系统生物学提出了一个观点，即复杂体系中群体微生物的组成及比例都会影响体系的功能。由于分离培养方法会改变原始菌群的构成，无法分析微生物之间以及微生物与环境之间的相互关系，所以不适于白酒酿造过程的实时监测。分子生态学方法在白酒的研究中开始得到应用。DGGE技术是由Fisher和Lerman在1979年率先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术，其基本原理是由于双链DNA在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，不同长度的DNA片段能够被区分开来(迁移行为决定于其分子大小和电荷)，但同样长度的DNA片段因在胶中迁移行为一样而无法区分开来。因此在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂(尿素和甲酰胺)梯度，不同序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度下解链，发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，最后停滞在其相应的变性剂梯度位置，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。DGGE由于能有效分析复杂体系中微生物群落结构组成，而越来越受到重视。如今，由于DGGE具有能检测到难以培养或不能培养的微生物、检测速度快、重现性强、结果准确可靠、方便易操作等优点，被广泛应用于多个微生态系统领域的研究中，包括土壤、海洋湖泊、人体和动物肠道、发酵食品等等，是研究复杂体系中微生物群落结构组成以及菌群多样性动态变化分析主要的分子生物学方法之一。由于PCR扩增的偏好性，用细菌16S rDNA V3区的通用引物分析白酒大曲和酒醅，往往会低估的多样性。为针对研究的群体结构，用选择16S rDNA V9区基因作为DGGE的靶基因。为降低PCR扩增的偏好性、提高扩增的特异性，采用巢式PCR获得特异性片段。巢式PCR基本原理是利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，第一对引物(外引物)用以产生扩增产物。第二对引物称为巢式引物，它们结合在第一次PCR产物的内部，使第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。由于巢式PCR有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性， 因而巢式PCR特异性强、准确度高、可靠性闻。应用巢式PCR-DGGE分析中国白酒发酵体系中的菌群多样性具有明显的优势，其操作简便、检测速度快、重复性好、结果准确可靠，直接鉴定到种水平，而且能检测到难以培养或不能培养的运用此方法半定量分析白酒实际发酵体系中Bacillus的群落结构组成及其比例，对准确把握白酒发酵过程中种属以及动态演变规律，深入了解白酒生产过程中与特殊风味物质、重要酶类物质相关的关键微生物的变化规律与产品质量及成分组成之间的相关关系，指导生产工艺的改进具有重要的理论和实践意义。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有的传统微生物分离方法的缺陷，公开一种运用巢式PCR结合变性梯度凝胶电泳的方法来半定量分析白酒发酵体系中的结构组成及其比例。本专利技术采用的技术，具有快速、简便、准确度高、特异性强的优点。为确定白酒发酵体系中Bacillus群落结构组成以及白酒发酵过程中菌群动态演变规律提供了快速检测方法，结合实验室培养条件下单菌种的特性分析，可判断其在白酒酿造过程中的功能以及贡献程度，所以为白酒中功能微生物的研究提供了参考依据。本专利技术的技术方案利用珠磨法提取大曲或酒醅样品基因组，巢式PCR两轮扩增Bacillus特异性DNA片段，DGGE电泳分离不同种属的对应的DNA片段，切胶回收优势微生物对应的条带，再次PCR扩增及连接T载体和阳性克隆的挑选，DGGE电泳重新比对后，进行测序鉴定切胶条带对应的微生物信息，最后利用quantity one软件将DGGE图谱条带亮度进行数字化处理，计算出某种沒电总、饱Bacillus菌群中所占有的比例。用变性梯度凝胶电泳定性并半定量分析白酒发酵体系中群落结构的方法，包括以下步骤 (a)选择实验的大曲或酒醅样品，对样品进行预处理，并用珠磨法提取样品中微生物的总基因组DNA ； ih、麵BaciIIus的16S rRNA V9区基因作为DGGE的靶基因设计两对引物，并在第二轮PCR的正向引物的5’端加上GC发夹结构； 巢式PCR所用的第一轮专一性引物为 pl-F :5，-CGATGCGTAGCCGACCTGAG-3，，pl-R :5’ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ ； 第二現钦对Bacillus 16S rDNA V9区的引物为 p2-F :5，-ATGGCTGTCGTCAGCT-3，，p2-R:5’ -CGCCCGCCGC GCGGCGGGCG GGGCGGGGGC ACGGGCGGTG TGTAC-3’ ； (c)以步骤(a)中的基因组为模板进行PCR扩增； (d)将PCR产物在最适条件下进行DGGE电泳分析； Ce)染色后与已知的Maker比对，确定具有相同电泳迁移率的DNA条带相应的种属，将未知的优势条带切胶回收； (f )回收的DNA条带重新PCR扩增、连接T载体，转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布于加有一定浓度Amp的LB平板，挑选阳性克隆子； (g)对阳性克隆子的菌落PCR产物，再次进行DGGE比对、验证； (h)将与回收DNA条带具有相同电泳迁移率的PCR产物进行测序，测序结果在GenBank数据库中blast比对分析； (i)本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用变性梯度凝胶电泳定性并半定量分析白酒发酵体系中群落结构的方法，其特征在于包括以下步骤 (a)选择实验的大曲或酒醅样品，对样品进行预处理，并用珠磨法提取样品中微生物的总基因组DNA ； ih、麵BaciIIus的16S rRNA V9区基因作为DGGE的靶基因设计两对引物，并在第二轮PCR的正向引物的5’端加上GC发夹结构； 巢式PCR所用的第一轮专一性引物为 pl-F :5，-CGATGCGTAGCCGACCTGAG-3，， pl-R :5’ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ ； 第二現钦对Bacillus 16S rDNA V9区的引物为 p2-F :5，-ATGGCTGTCGTCAGCT-3，，p2-R:5’ -CGCCCGCCGC GCGGCGGGCG GGGCGGGGGC ACGGGCGGTG TGTAC-3’ ； (c)以步骤(a)中的基因组为模板进行PCR扩增； Cd)将PCR产物在最适条件下进行DGGE电泳分析； Ce)染色后与已知的Maker比对，确定具有相同电泳迁移率的DNA条带相应的种属，将未知的优势条带切胶回收； (f )回收的DNA条带重新PCR扩增、连接T载体，转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布于加有一定浓度Amp的LB平板，挑选阳性克隆子； (g)对阳性克隆子的菌落PCR产物，再次进行DGGE比对、验证； (h)将与回...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐岩，王海燕，吴莉莉，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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