一种新型聚合酶链反应微流体芯片控制系统及其制备方法技术方案

本发明专利技术涉及一种新型聚合酶链反应（PCR）微流体芯片控制系统及其制备方法。结构主体由一条参照通道和多条实验通道组成，包括参照组溶液入口、参照组油相入口、实验组油相入口、实验组溶液入口、参照组阀门、实验组阀门、矩形通道、圆柱空腔和出口。制备方法具体为：（1）初始模板a，（2）PDMS模板b，（3）PDMS模板c，（4）NOA树脂通道d，（5）NOA树脂盖板e，（6）微流体芯片控制系统f。本发明专利技术利用在油相对溶液的微流体剪切作用，可以产生量级在纳升甚至皮升大小的液滴，极大地降低了使用样品量，达到与传统PCR技术相当的测试效率。本发明专利技术所用的主要材料是NOV81合成树脂，其价格低廉，有良好的生物相容性，光透性好，有效防止溶液挥发，机械性能优异，并且芯片制作工艺简单、快捷、易操作。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微加工技术应用领域，具体涉及一种新型聚合酶链反应（PCR）微流体芯片控制系统及其制备方法。该系统在聚合酶链反应（PCR）过程前，利用微流体控制系统产生量级为纳升甚至皮升的微液滴，从而实现诸如RNA、DNA的基因扩增。
技术介绍
聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)是最常用的分子生物学技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增。PCR技术有特异性高、灵敏度强、快速、简便等诸多优点，在过去的几十年里，PCR技术已经被广泛地应用在不同的领域，比如食品工业、医学、病毒检测、生物学研究等基础领域。PCR技术自从1985年由Millus创立后，经历20多年的飞速发展，已成为不可或缺的一项重要微生物应用技术，主要包括：反转录PCR技术、定量PCR技术、实时荧光定量PCR技术、重组PCR技术、反向PCR技术和多重PCR技术等。但是，传统的PCR技术需要大量昂贵的生物样品，使得测试成本很高，并且无法实现单个细胞的基因测试，进而不能有效识别单细胞之间的差异，使得其应用受到一定限制。近年来，随着微流体技术(Micro-fluid Technology)的快速发展，微流体生物芯片被视为是后基因时代用来解读基因序列之重要工具，受到极大的重视。微流体芯片，又被称为“芯片实验室”（Lab-on-a-chip），它是利用微机电技术将一般实验室所使用的分离纯化混合，以及酵素反应等装置微小化到芯片上，以进行生化反应、过程控制或分析，其构造远较微数组芯片复杂得多，可对微量流体（包括液体和气体）进行复杂、精确的操作，如：混合和分离微量流体、化学反应、微量分析等等。微流体芯片还可以在稀有细胞的筛选、信息核糖核酸的提取和纯化、基因测序、单细胞分析、蛋白质结晶等方面发挥独特的作用。因为其具有体积轻巧、使用样品/试剂量少、反应速度快、大量平行处理及可抛弃式等优点，因此在生物技术研究上的应用范围非常广泛。在过去10年中，微流体芯片技术的快速发展使得PCR过程可以在微型化的系统中完成成为可能，与传统PCR系统相比，其优势是不仅大大缩短了反应时间，而且极大地降低了所需的样本量。采用微流体芯片技术可以很容易获得量级在纳升甚至皮升、且尺度上非常均匀的液滴。这些分散的液滴有效地避免了彼此间的相互干扰，保证了在PCR过程中个体的独立性。该项技术使得单细胞基因测试逐步成为现实。传统的微流控芯片的制作通常采用玻璃、硅片或者是近几年非常流行的PDMS材料。玻璃和硅片的制作工艺复杂、成本极高，而PDMS由于其多孔性使得其在PCR过程中易造成容易的大量挥发，因此不适合制作应用于PCR过程的芯片系统。为了解决上述传统PCR过程中遇到的问题，本专利技术将一种新型微流体芯片技术应用到PCR过程中，提出了一种新型聚合酶链反应（PCR）微流体芯片控制系统。
技术实现思路
本专利技术针对传统PCR技术不能实现单细胞基因表达测试的问题，并应用一种新型微流体芯片技术，提出了一种新型聚合酶链反应（PCR）微流体芯片控制系统及其制备方法。本专利技术提出的一种新型聚合酶链反应（PCR）微流体芯片控制系统，由多条实验通道Ⅰ和一条参照通道Ⅱ组成，所述实验通道Ⅰ和参照通道Ⅱ采用折流式布置，所述实验通道Ⅰ入口端设有实验组油相入口3、实验组溶液入口4和实验组阀门6，所述实验组油相入口3与实验组溶液入口4相互垂直，且实验组油相入口3通道为水平通道，实验组溶液入口4通道为竖直通道，所述实验通道Ⅰ出口端设有第三出口12和第四出口13，实验通道Ⅰ中部由若干条第二矩形通道8按照首尾相接的形式折流布置而成，第二矩形通道8的平直段上设有圆柱形空腔9，相邻圆柱形空腔9边缘距离为200μm；所述参照通道Ⅱ入口端设有参照组溶液入口1、参照组油相入口2和参照组阀门5，所述参照组油相入口2与参照组溶液入口1相互垂直，且参照组油相入口2通道为水平通道，参照组溶液入口1通道为竖直通道，所述参照通道Ⅱ出口端设有第一出口10和第二出口11，参照通道Ⅱ中部由若干条第一矩形通道7按照首尾相接的形式折流布置而成，第一矩形通道7的平直段上设有圆柱形空腔9，相邻圆柱形空腔9边缘距离为200μm。    本专利技术中，所述第一矩形通道7和第二矩形通道8的矩形截面尺寸为200μm × 100μm，圆柱形空腔9直径为400μm、300μm或200μm中任一种，高为180μm，圆柱形空腔底部厚度为50μm。   本专利技术中，所述第一出口10、第二出口11、第三出口12和第四出口13的出口通道可以任意夹角，参照组阀门5通道与参照通道可以任意夹角，实验组阀门6通道与实验通道可以任意夹角。    本专利技术提出的一种新型PCR微流体芯片控制系统的制备方法，包括（1）制备初始模板a，（2）制备PDMS模板b，（3）制备PDMS模板c，（4）制备NOA树脂通道d，（5）制备NOA树脂盖板e，（6）制备微流体芯片控制系统f，具体步骤如下：(1)，制备初始模板a：在洁净室内，将硅片置于氢氟酸里进行清洗，去除天然氧化硅表层;接着将硅片置于95℃温度下加热5分钟，去除残留的氢氟酸；采用高速旋转涂胶机在硅片上涂一层厚度为100 μm的SU-8光刻胶，将所得硅片置于65℃的烘胶平台上进行烘烤5分钟，然后再在95℃的烘胶平台上烘烤25分钟，之后采用光刻机进行软光刻；将软光刻后的硅片分别置于65℃烘胶平台上烘烤5分钟，95℃平台上烘烤10分钟，待冷却后采用SU-8显影剂进行显影以除去多余的光刻胶，显影过程为10分钟，之后采用高速氮气清洁硅片表面，即得到图1所需通道形状的母版，也就是图5中所需的初始模板a；(2)，制备PDMS模板b：将步骤(1)得到的初始模板a放在锡纸折成的圆腔内，将按10:1质量比例混合的PDMS-RTV聚合物浇注在初始模板a的正面，并将其置于真空皿内脱气30分钟；脱气后，将其置于70℃的炉内烘烤至少1小时固化，形成初始模板a的负面模板，即PDMS模板b；(3)，制备PDMS模板c：将步骤(2)得到的PDMS模板b从初始模板a上脱离，并采用等离子机对其通道面进行活化1分钟；接着将其置于装有三氯硅烷的封闭容器中2小时，待其在通道表面上形成一层氧化硅表层后；将所得PDMS模板b再次放在锡纸折成的圆腔内，通道面朝上，浇注按10:1质量比例混合的PDMS-RTV聚合物，再次放入真空皿内脱气30分钟，后在70℃下烘烤1小时，形成与初始模板a相同形状的PDMS模板c，并将其从PDMS模板b上剥离，备用；(4)，制备NOA树脂通道d：将一载玻片放在一平板PDMS支撑面上，在载玻片顶部轻轻地施加压力消除存在于载玻片和平板PDMS之间的空气；在载玻片上面涂一层平均厚度约120μm的NOA合成树脂，将步骤(3)得到的PDMS模板c置于NOA81合成树脂上面与之对其，从顶部施加压力以排除大气泡，而小气泡则被吸收到PDMS模板c内，使得NOA81合成树脂完全将PDMS模板c的突出包住，之后将其置于强度为30%的紫外灯下照射6.5秒使NOA81合成树脂固化，最后轻轻将PDMS模板c取下，得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型聚合酶链反应微流体芯片控制系统，其特征在于由多条实验通道(Ⅰ)和一条参照通道(Ⅱ)组成，所述实验通道(Ⅰ)和参照通道(Ⅱ)采用折流式布置，所述实验通道(Ⅰ)入口端设有实验组油相入口(3)、实验组溶液入口(4)和实验组阀门(6)，所述实验组油相入口(3)与实验组溶液入口(4)相互垂直，且实验组油相入口(3)通道为水平通道，实验组溶液入口(4)通道为竖直通道，所述实验通道(Ⅰ)出口端设有第三出口(12)和第四出口(13)，实验通道(Ⅰ)中部由若干条第二矩形通道(8)按照首尾相接的形式折流布置而成，第二矩形通道(8)的平直段上设有圆柱形空腔(9)，相邻圆柱形空腔(9)边缘距离为200μm；所述参照通道(Ⅱ)入口端设有参照组溶液入口(1)、参照组油相入口(2)和参照组阀门(5)，所述参照组油相入口(2)与参照组溶液入口(1)相互垂直，且参照组油相入口(2)通道为水平通道，参照组溶液入口(1)通道为竖直通道，所述参照通道(Ⅱ)出口端设有第一出口(10)和第二出口(11)，参照通道(Ⅱ)中部由若干条第一矩形通道(7)按照首尾相接的形式折流布置而成，第一矩形通道(7)的平直段上设有圆柱形空腔(9)，相邻圆柱形空腔(9)边缘距离为200μm。...

【技术特征摘要】
1.一种新型聚合酶链反应微流体芯片控制系统，其特征在于由多条实验通道(Ⅰ)和一条参照通道(Ⅱ)组成，所述实验通道(Ⅰ)和参照通道(Ⅱ)采用折流式布置，所述实验通道(Ⅰ)入口端设有实验组油相入口(3)、实验组溶液入口(4)和实验组阀门(6)，所述实验组油相入口(3)与实验组溶液入口(4)相互垂直，且实验组油相入口(3)通道为水平通道，实验组溶液入口(4)通道为竖直通道，所述实验通道(Ⅰ)出口端设有第三出口(12)和第四出口(13)，实验通道(Ⅰ)中部由若干条第二矩形通道(8)按照首尾相接的形式折流布置而成，第二矩形通道(8)的平直段上设有圆柱形空腔(9)，相邻圆柱形空腔(9)边缘距离为200μm；所述参照通道(Ⅱ)入口端设有参照组溶液入口(1)、参照组油相入口(2)和参照组阀门(5)，所述参照组油相入口(2)与参照组溶液入口(1)相互垂直，且参照组油相入口(2)通道为水平通道，参照组溶液入口(1)通道为竖直通道，所述参照通道(Ⅱ)出口端设有第一出口(10)和第二出口(11)，参照通道(Ⅱ)中部由若干条第一矩形通道(7)按照首尾相接的形式折流布置而成，第一矩形通道(7)的平直段上设有圆柱形空腔(9)，相邻圆柱形空腔(9)边缘距离为200μm。
2.根据权利要求1所述的新型聚合酶链反应微流体芯片控制系统，其特征在于所述第一矩形通道(7)和第二矩形通道(8)的矩形截面尺寸为200μm × 100μm，圆柱形空腔(9)直径为400μm、300μm或200μm中任一种，高为180μm，圆柱形空腔底部厚度为50μm。
3.根据权利要求1所述的新型聚合酶链反应微流体芯片控制系统，其特征在于所述第一出口(10)、第二出口(11)、第三出口(12)和第四出口(13)的出口通道为任意夹角，参照组阀门(5)通道与参照通道为任意夹角，实验组阀门(6)通道与实验通道为任意夹角。
4.一种如权利要求1所述的新型PCR微流体芯片控制系统的制备方法，其特征在于包括（1）制备初始模板a，（2）制备PDMS模板b，（3）制备PDMS模板c，（4）制备NOA树脂通道d，（5）制备NOA树脂盖板e，（6）制备微流体芯片控制系统f，具体步骤如下：
(1)，制备初始模板a：在洁净室内，将硅片置于氢氟酸里进行清洗，去除天然氧化硅表层;接着将硅片置于95℃温度下加热5分钟，去除残留的氢氟酸；采用高速旋转涂胶机在硅片上涂一层厚度为100 μm的SU-8光刻胶，将所得硅片置于65℃的烘胶平台上进行烘烤5分钟，然后再在95℃的烘胶平台上烘烤25分钟，之后采用光刻机进行软光刻；将软光刻后的硅片分别置于65℃烘胶平台上烘...

【专利技术属性】
技术研发人员：李卓，徐海霞，崔鹏义，余明博，毛云峰，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：上海;31