一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的分子标记制造技术

本发明专利技术提供了一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的分子标记及其引物对。根据所述分子标记设计的扩增引物对和测序引物对，可对奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化进行检测。所述检测的方法为：将待测奶牛的基因组DNA经过重亚硫酸盐处理，利用扩增引物对进行TRAPPC9基因的PCR扩增，再利用测序引物对配合焦磷酸仪进行测序，即可检测待测奶牛的TRAPPC9基因启动子区的甲基化程度。本发明专利技术为培育具乳房炎抗性的奶牛分子育种提供理论依据和遗传基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子标记，具体地说，涉及一种检测DNA甲基化的分子标记。
技术介绍
奶牛乳房炎是影响世界奶业发展的主要疾病之一，也是造成奶牛养殖损失最主要的疾病。奶牛乳房炎不仅会影响奶牛的产奶量，降低原料奶的品质，还会影响奶牛正常生理功能，增加母牛流产率及淘汰率。奶牛乳房炎的遗传力较低，仅为0.02-0.04之间，传统的育种方法对其选择效果不明显。随着分子遗传学、数量遗传学和分子生物学技术的飞速发展，分子育种技术逐步应用到畜禽育种中去，并取得了一定的成果。奶牛乳房炎受环境影响较大，研究者们正致力于通过寻找与奶牛乳房炎抗性相关的表观遗传分子标记及相关靶基因来选择乳房炎抗性高的个体，为培育具有乳房炎抗性的奶牛新品系奠定基础。表观遗传学是指DNA的序列没有发生改变，而基因的表达却发生了可遗传的变化。表观遗传学的修饰方式和调节机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等方面。这些修饰方式和调节机制易受环境的作用，因此与经典遗传学相比，表观遗传学更关注环境诱导的可遗传变异。DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基转移酶的作用下，CpG二核苷酸的胞嘧啶(C)被选择性地添加甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化对奶牛乳房炎的发生、发展和维持具有重要的影响。转运蛋白颗粒复合体9基因(trafficking protein particle complex 9,TRAPPC9)位于奶牛的14号染色体上，全长387232bp，cDNA全长4179bp，拥有22个外显子。其编码的蛋白转运蛋白颗粒复合体9也叫做NIBP(NIK and IKKβ-binding protein)，具有参与NF-κB信号通路激活的过程、参与膜泡运输、参与内质网到高尔基体的囊泡转移和参与神经细胞的分化等功能。NF-κB信号通路是一个非常重要的炎症调控通路，尤其是在维持表皮和上皮细胞内环境稳态中发挥着重要的作用。大量研究表明NF-κB信号通路在奶牛乳房炎发生、发展过程中发挥着重要调控作用。我们前期研究发现，TRAPPC9基因是奶牛乳房炎抗性的重要候选基因，但目前关于奶牛TRAPPC9基因的DNA甲基化对乳房炎抗性的影响还没有报道。目前，定性研究DNA甲基化的方法有很多，而定量分析DNA甲基化水平的方法却很少，而且费用昂贵，通量低。新发展的焦磷酸测序技术，是针对目的基因DNA甲基化进行定量分析的新一代测序技术，目前，该测序平台已经升级到第二代，一次能够检测400bp的序列。该技术通过预先设计的反应体系，在一次检测中快速、准确、定量一个或多个甲基化位点，是目前最理想的DNA甲基化定量分析技术。目前，焦磷酸测序法在人类疾病检测中有很多报道，但在传统的动物疾病研究中鲜有报道。因此利用焦磷酸测序方法进行奶牛乳房炎抗性候选基因的DNA甲基化定量分析，对研究奶牛乳房炎抗性具有重要意义。同时，也为后续的分子育种提供了可靠的表观遗传学分子标记素材和理论基础。
技术实现思路
为了解决现有技术中对奶牛乳房炎抗性基因的DNA甲基化研究的缺陷，本专利技术的目的是提供一种检测奶牛乳房炎抗性的TRAPPC9基因甲基化的分子标记及其引物。为了实现本专利技术的目的，本专利技术首先提供了一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的分子标记，所述分子标记是通过针对牛TRAPPC9基因，选取其启动子区内的一段富含CpG二核苷酸的序列，将其CG座位替换为YG座位，再将其余C碱基全部替换为T碱基而得到。具体地，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本专利技术还提供了一种用于扩增前述分子标记的扩增引物对，所述扩增引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本专利技术还提供了一种用于检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的测序引物，所述测序引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。本专利技术还提供了一种包含前述测序引物对试剂盒。本专利技术还提供了一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的方法，所述方法包括以下步骤：1)提取待测奶牛基因组DNA；2)基因组DNA的重亚硫酸盐处理；3)以步骤2)处理后的基因组DNA为模板，利用前述扩增引物对，在其下游引物的5’端按照5’→3’方向连接通用引物，并在有生物素标记的通用引物的参与下，进行热启动PCR扩增，得到PCR扩增产物；其中，所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；4)利用前述测序引物对，用焦磷酸仪对步骤3)获得的PCR产物进行测序，定量检测CpG座位的甲基化程度。进一步地，所述步骤3)中PCR扩增的反应体系为：重亚硫酸盐处理的基因组DNA 4μl，10μM的上游扩增引物1μl，10μM的下游扩增引物0.1μl，10μM的通用引物0.9μl，ddH2O 14μl，Zymo Premix 20μl；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性15min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，45个循环；72℃延伸10min；4℃保存。其中，前述方法中所述的奶牛为荷斯坦牛。本专利技术还提供了一种优化奶牛育种的方法，具体为利用前述方法检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化，筛选出基因启动子区甲基化标记中DNA未甲基化的TRAPPC9基因的奶牛进行育种。本专利技术还提供了前述分子标记在优化奶牛育种中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过前述分子标记设计的TRAPPC9基因DNA甲基化引物序列具有较强特异性，配合焦磷酸仪，可用于有效、准确、定量检测奶牛TRAPPC9基因DNA甲基化程度。该特异引物所检测出的TRAPPC9基因甲基化作为新型的表观遗传分子标记，为培育具乳房炎抗性的奶牛分子育种提供理论依据和遗传基础。附图说明图1为4头试验中国荷斯坦奶牛的焦磷酸测序结果图；其中：A和B所示个体属于乳房炎易感个体；C和D所示个体属于乳房炎抗性个体。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1与中国荷斯坦牛乳房炎抗性相关的DNA甲基化分子标记甲基化水平的检测1.1待测中国荷斯坦奶牛血液基因组DNA提取尾静脉采集待测中国荷斯坦奶牛血液，常温放置3-4小时待本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的分子标记，其特征在于，所述分子标记是通过针对牛TRAPPC9基因，选取其启动子区内的一段富含CpG二核苷酸的序列，将其CG座位替换为YG座位，再将其余C碱基全部替换为T碱基而得到。

【技术特征摘要】
1.一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的分子标记，其特征
在于，所述分子标记是通过针对牛TRAPPC9基因，选取其启动子区内
的一段富含CpG二核苷酸的序列，将其CG座位替换为YG座位，再将
其余C碱基全部替换为T碱基而得到。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记
的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种用于扩增权利要求1或2所述的分子标记的扩增引物对，
其特征在于，所述扩增引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID 
No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
4.一种用于检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的测序引物，其
特征在于，所述测序引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
5.包含权利要求4所述的测序引物的试剂盒。
6.一种检测奶牛乳房炎抗性的DNA甲基化的方法，其特征在于，
所述方法包括以下步骤：
1)提取待测奶牛基因组DNA；
2)基因组DNA的重亚硫酸盐处理；
3)以步骤2)处理后的基因组DNA为模板，利用权利要求3所述
的扩增引物对，在其下游引物的5’端按照5’→3’方向连接通用引
物，并在有生物素标记...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞英，董易春，王晓，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11