一种与猪产仔数相关的microRNA标记应用制造技术

本发明专利技术属于家畜分子生物技术领域，提供一种与猪产仔数相关的microRNA标记应用，该方法以miR‑429、ZEB1、LHβ为标记基因，通过比较不同母猪个体之间标记基因miR‑429、ZEB1、LHβ在垂体中的相对表达量，判断不同母猪个体之间产仔能力相对高低，标记基因miR‑429表达量高的个体比标记基因miR‑429表达量低的个体产仔能力高。具体的调控机理是miR‑429通过抑制垂体中ZEB1基因的表达而间接促进LHβ基因的表达，进而提高母猪的产仔数。本发明专利技术根据与猪产仔数相关的microRNA标记表达情况可以快速获得母猪产仔能力尤其是大约克夏和皖南黑猪的产仔能力，避免了外界环境因素对产仔能力判断的失误，减少选育过程中的复杂性，从分子水平上的检测大大缩短了育种的时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于家畜分子生物
，涉及标记基因miR-429对下游基因调控在母猪产仔能力判断方面的应用。
技术介绍
二十世纪50年代以来，国内外猪的育种工作经历了从脂肪型到瘦肉型的转变取得了显著成效，然而对于低遗传力的繁殖性状和难以活体测定的肉质性状，遗传改良的进展十分缓慢。猪产仔性能是决定猪繁殖能力及现代养猪业经济的重要因素之一。据Clutter等根据英国目前猪的养殖规模测算，只要将猪产仔数提高1-1.5头，英国养猪业每年可获得7亿英镑的额外利润；所以通过提高每头母猪断奶仔猪的数量就可以以较小的额外投入，增加养猪生产者的经济回报。因此猪的产仔数性状倍受育种者和生产者的关注，已经成为我国当前猪遗传育种的研究重点。猪的繁殖过程主要依赖于下丘脑-垂体-性腺轴的调控，这个过程受到基因与环境之间相互作用的影响。MicroRNA为一类长约21～24nt的非编码小RNA，其通过对靶基因的转录后调控广泛参与真核生物的生殖、发育、病毒防御、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等生命活动中。近年来，关于猪miRNAs的研究逐渐增多，但主要集中在猪的生长发育、疾病发生等相关方面。关于miRNAs对猪繁殖性能调控的研究则相对较少，对于miRNA如何在下丘脑-垂体-性腺轴中发挥作用尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于以大约克夏和皖南黑猪为试验对象，通过实时荧光定量PCR技术了解miR-429在高低产仔数母猪生殖轴组织(垂体、下丘脑、卵巢、子宫、输卵管)中的表达差异及规律，分析这些miRNAs可能在哪些组织发挥作用及的作用机制，以期为猪的候选miRNAs及优良品种选育和利用提供参考。1.本专利技术提供标记基因miR-429对下游基因调控在母猪产仔能力判断方面的应用，所述下游基因为ZEB1和LHβ；miR-429对下游基因调控为抑制靶基因ZEB1的表达，ZEB1与LHβ基因之间呈负调控关系，miR-429通过抑制靶基因ZEB1的表达间接上调LHβ基因表达；标记基因miR-429与母猪产仔能力呈正相关，靶基因ZEB1与母猪产仔能力呈负相关，靶基因LHβ与母猪产仔能力呈正相关；通过分析标记基因miR-429表达水平判断母猪产仔能力大小。2.上述1提供的应用，该应用通过分析标记基因miR-429和靶基因ZEB1表达水平判断母猪产仔能力大小。3.上述1提供的应用，该应用通过分析标记基因miR-429和靶基因LHβ表达水平判断母猪产仔能力大小。4.上述1提供的应用，该应用通过分析标记基因miR-429、靶基因LHβ和靶基因ZEB1表达水平判断母猪产仔能力大小。5.上述1-4任一项提供的应用，该应用方法具体包括如下步骤：(1)组织RNA提取：提取不同个体母猪的输卵管和垂体RNA；(2)引物设计：根据待分析目标基因分别设计候选基因miR-429的q-RT-PCR引物ssc-miR-429、ZEB1的q-RT-PCR引物ZEB1、LHβ的q-RT-PCR引物LHβ；(3)反转录合成cDNA：使用反转录试剂盒对反转录步骤(1)得到的总RNA合成cDNA；(4)采用q-RT-PCR方法测定候选基因miR-429、ZEB1、LHβ在母猪输卵管和垂体中的相对表达量；(5)根据miR-429在输卵管和垂体中的表达量，ZEB1和LHβ在垂体的表达量；判断不同母猪个体之间产仔能力相对高低；其中，引物ssc-miR-429序列如SEQIDNO.1所示；引物对LHβ上游序列如SEQIDNO.2所示，下游序列如SEQIDNO.3所示；引物对ZEB1上游序列如SEQIDNO.4所示，下游序列如SEQIDNO.5所示。6.上述5提供的应用，其中，步骤(2)中还包括内参基因引物的设计，其中，miR-429的内参基因为U6，引物序列如SEQIDNO.6所示；LHβ和ZEB1的内参基因为β-Actin，上游引物序列如SEQIDNO.7所示，下游引物序列如SEQIDNO.8所示。7.上述5提供的应用，其中，步骤(3)中反转录试剂盒Invitrogencode：A11193051进行翻转录，反转录体系为20μL，miR-429反转录过程体系中，总RNA1μL，SuperScriptR酶混合2μL，反应混合物4μL，超纯水加至20μL；反应条件为：在37℃下60min，95℃维持5sec灭活反转录酶；LHβ和ZEB1反转录过程体系中，总RNA2.0μL，gDNAEraser1μL，5×gDNAEraserBuffer2.0μL，超纯水加至20μL；反应条件为：37℃反应15min，85℃维持5sec灭活反转录酶；步骤(4)所述q-RT-PCR方法中反应体系为：miR-429为20μL反应体系，EXPRESSGreenERTMqPCR绿色荧光染料10μL，2μL引物ssc-miR-429、cDNA2μL加超纯水至20μL；LHβ反应体系，iTaqTMUniversalGreenSupermix绿色荧光染料7.5μL、引物对LHβ上下游序列各0.5μL，cDNA1.5μL，超纯水加至20uL：ZEB1反应体系同LHβ，引物对为ZEB1；反应过程为：miR-429为95℃20s、95℃5s、60℃20s，40个循环，于60℃20s时收集荧光值；LHβ和ZEB1为95℃3min、95℃5s、60℃30s，40个循环，于60℃30s时收集荧光值；其中，所述母猪品种为皖南黑猪和大约克夏猪。8.本专利技术还提供标记基因miR-429对下游基因调控机制的研究方法，本方法以皖南黑猪和大约克夏猪为对象，通过双荧光素酶实验确定了在猪中ssc-miR-429靶向于ZEB1的3’-UTR区域；通过凝胶迁移试验明确了猪中转录因子ZEB1和LHβ的靶向关系。9.上述8所述的研究方法，其中，双荧光素酶基因中所用载体包括荧光素酶报告载体：pGL3-Control，所用的酶切位点XbaI；miRNA表达载体：pmr-mcherry，所用的酶切位点为BglII和XbaI；引物包括PGL3-ZEB1和ssc-miR-429，其中，引物PGL3-ZEB1上游序列如SEQIDNO.9所示，下游序列如SEQIDNO.10所示；引物ssc-miR-429上游序列如SEQIDNO.11所示，下游序列如SEQIDNO.12所示。10.上述8所述的研究方法，其中，凝胶迁移试验中DNA探针为T1和T2，其中，T1上游序列如SEQIDNO.13所示，下游序列如SEQIDNO.14所示；T2上游序列如SEQIDNO.15所示，下游序列如SEQIDNO.16所示。本申请提供的“比较”概念是个体间的比较，根据不同个体间标记基因miR-429、靶基因ZEB1和LHβ表达量，可以确定不同个体间产仔能力的大小。“高”“低”通过个体之间数据比较获得，是一个相对的概念。本专利技术具有如下优点：1.本申请获得了猪种垂体中miR-429，ZEB1和LHβ三者之间的靶向关系关系，填补了现有技术的空白，由此得出母猪产仔能力与候选基因表达差异之间的关系，为今后品种选育和新品系的建立提供参考。2.本专利技术明确了在母猪尤其是皖南黑猪和大约克夏猪品种中，垂体和输卵管中miR-429表达量差异，快速判断出不同母猪个体间产仔能力高低情况，同时结合垂体中ZEB1和LHβ表达量差异，更本文档来自技高网...

【技术保护点】
标记基因miR‑429对下游基因调控在母猪产仔潜力判断方面的应用，其特征在于：所述下游基因为ZEB1和LHβ；miR‑429对下游基因调控为抑制靶基因ZEB1的表达，ZEB1与LHβ基因之间呈负调控关系，miR‑429通过抑制靶基因ZEB1的表达间接上调LHβ基因表达；标记基因miR‑429与母猪产仔潜力呈正相关，靶基因ZEB1与母猪产仔潜力呈负相关，靶基因LHβ与母猪产仔潜力呈正相关；通过分析标记基因miR‑429表达水平判断母猪产仔潜力大小。

【技术特征摘要】
1.标记基因miR-429对下游基因调控在母猪产仔潜力判断方面的应用，其特征在于：所述下游基因为ZEB1和LHβ；miR-429对下游基因调控为抑制靶基因ZEB1的表达，ZEB1与LHβ基因之间呈负调控关系，miR-429通过抑制靶基因ZEB1的表达间接上调LHβ基因表达；标记基因miR-429与母猪产仔潜力呈正相关，靶基因ZEB1与母猪产仔潜力呈负相关，靶基因LHβ与母猪产仔潜力呈正相关；通过分析标记基因miR-429表达水平判断母猪产仔潜力大小。2.权利要求1所述的应用，其特征在于：通过分析标记基因miR-429和靶基因ZEB1表达水平判断母猪产仔潜力大小。3.权利要求1所述的应用，其特征在于：通过分析标记基因miR-429和靶基因LHβ表达水平判断母猪产仔潜力大小。4.权利要求1所述的应用，其特征在于：通过分析标记基因miR-429、靶基因LHβ和靶基因ZEB1表达水平判断母猪产仔潜力大小。5.权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，该应用方法具体包括如下步骤：(1)组织RNA提取：提取不同个体母猪的输卵管和垂体RNA；(2)引物设计：根据待分析目标基因分别设计候选基因miR-429的q-RT-PCR引物ssc-miR-429、ZEB1的q-RT-PCR引物ZEB1、LHβ的q-RT-PCR引物LHβ；(3)反转录合成cDNA：使用反转录试剂盒对反转录步骤(1)得到的总RNA合成cDNA；(4)采用q-RT-PCR方法测定候选基因miR-429、ZEB1、LHβ在母猪输卵管和垂体中的相对表达量；(5)根据miR-429在输卵管和垂体中的表达量，ZEB1和LHβ在垂体的表达量；判断不同母猪个体之间产仔能力相对高低；其中，引物ssc-miR-429序列如SEQIDNO.1所示；引物对LHβ上游序列如SEQIDNO.2所示，下游序列如SEQIDNO.3所示；引物对ZEB1上游序列如SEQIDNO.4所示，下游序列如SEQIDNO.5所示。6.权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤(2)中还包括内参基因引物的设计，其中，miR-429的内参基因为U6，引物序列如SEQIDNO.6所示；LHβ和ZEB1的内参基因为β-Actin，上游引物序列如SEQIDNO.7所示，下游引物序列如SEQIDNO.8所示。7.权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤(3)中用反转录试剂盒Invitrogencode：A11193051进行翻转录，反转录体系为20μL，mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓东，殷宗俊，丁月云，冯羿方，吴涛，叶鹏飞，黄龙，王姝琪，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34