芋疫霉菌环介导等温扩增检测引物及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种芋疫霉菌环介导等温扩增（LAMP）检测引物及其快速检测方法，可用于芋疫霉菌的特异性检测。通过设计芋疫霉菌的LAMP检测引物，经恒温扩增，采用SYBR green Ⅰ显色剂显色或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形带。本发明专利技术的LAMP引物及检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好、实现了恒温扩增，为芋疫霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于生产实践中芋疫霉菌感染的植株或者发病初期芋疫霉菌的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为防治芋疫病提供可靠的技术和理论依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农作物病害检测、鉴定及防治
，具体涉及一种芋疫霉菌的环介导等温扩增（LAMP）检测引物及其快速检测方法，可用于芋疫霉菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于芋头疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。
技术介绍
芋疫霉菌（Phytophthoracolocasiae）属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)。芋疫霉菌是芋头生产上的一种危害极为严重的病原菌。由芋疫霉菌侵染引起的芋头疫病是芋头栽培中的主要病害之一，在芋头产区广泛分布与发生。该病初侵染主要来源于带菌的种苗和遗留田间的病株，一般4月份开始零星发生，6-9月盛行，发病率一般为20%-35%，主要危害叶片、叶柄，严重时亦危害球茎，遇高温、雨天病斑快速发展，导致叶片大量腐烂、植株折倒枯死，造成芋头产量和品质下降，芋头受害之后，产量损失高达30%-40%。近年来，随着种植结构的调整及经济效益的提升，芋头种植面积不断扩大，但是由于连年种植，芋疫病呈逐年加重趋势。芋疫霉菌具有很强的侵染性，一旦扩散蔓延则难以控制，如果能够在芋疫霉菌感染早期，及时、准确地进行检测鉴定，可以做到提前预防，如选择敏感有效的杀菌剂，对控制病情的流行大暴发具有重要意义。因此，建立一种能够快速、准确的监测和鉴别芋疫霉菌的检测方法对于我国芋头的安全生产具有重大的意义。植物病原菌传统的检测方法是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，来确定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是易遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的暴发，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要。随着分子生物学技术的不断发展，应用PCR、血清免疫学等技术对病原菌进行特异和快速分子检测的成功例子已越来越多，但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处，如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性，PCR快速检测技术主要包括常规PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和实时荧光定量PCR等，PCR技术检测时间较长，需要依靠PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备，不利于基层生产上推广应用，上述缺欠限制了这些先进方法的推广应用。环介导等温扩增（Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP）技术是由日本荣研公司开发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术，该技术可在60℃~65℃恒温条件下，利用高活性的链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)对目的DNA片段进行特异性扩增。在1小时内，能够将少量拷贝数的目的基因扩增至109~1010个拷贝数。LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、real-timePCR仪及凝胶电泳仪进行检测，而且还可以通过SYBRGreenⅠ、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后，肉眼识别。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济，且无需特殊设备，检测结果可由肉眼判断，极适合于在基层生产部门推广应用，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，关于芋疫霉菌的LAMP检测国内外均未见报道。本专利技术基于环介导等温扩增（LAMP）技术原理，选取疫霉菌Ypt1基因为检测靶标，在Ypt1基因靶标序列的6个区域设计了4条芋疫霉菌特异性引物，通过对反应体系和反应条件的优化，建立以SYBRGreenⅠ为荧光显色指示剂的芋疫霉菌可视化LAMP检测技术。该技术操作简单、灵敏度和特异高，且无需贵重仪器设备，适宜于田间芋疫病的早期诊断和病原菌的检测和鉴定，对芋疫病及时、有效的防治具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供芋疫霉菌环介导等温扩增检测引物及检测方法，针对现有技术中对芋疫霉菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了一种芋疫霉菌LAMP检测引物及其快速检测方法，本专利技术检测方法易于操作、特异性强、灵敏度高、结果准确可靠。实现本专利技术的目的包括下列步骤（技术方案）：1.芋疫霉菌LAMP检测特异性引物的设计：通过测定芋疫霉菌（Phytophthoracolocasiae）和其它疫霉菌（Phytophthoraspp）的Ypt1基因序列，对疫霉属不同种间Ypt1基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件PrimersoftwareExplorerV4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html;EikenChemicalCo.,Japan)设计一套芋疫霉菌特异性LAMP引物，包括1对外侧引物PcoF3/PcoB3和1对内侧引物PcoFIP/PcoBIP，其序列为：外侧引物：PcoF3:5’-ACTCGTCATCCACCTGAGT-3’，PcoB3:5’-CCACTGCTTGACGTTGTTGA-3’；内侧引物：PcoFIP:5’-AATCGTGCGGAAACGCTCCTGTGGTTGTGCCAACTCCCT-3’，PcoBIP:5’-CTAGCAGCTACTACCGTGGTGCCTCTTGGTCCGTCACATCG-3’。2.芋疫霉菌LAMP检测方法的建立，包括以下步骤：（1）提取待测样品基因组DNA为模板。用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µL2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2%CTAB；100mmol/LTris-HCl,pH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl）和90µLSDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000r·min-1离心15min；取上清液700µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（体积比25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min-1离心9min；取上清液500µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r·min-1离心5min；取上清液350µL，加入1/10体积3mol·L-1NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min-1离心5min；弃去上清液，加入700µL冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60µLTE（10mmol/LTris-HCl，0.1mmol/LEDTA，pH8.0）溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至100ng/µL待用。用于检测芋头组织中存在芋疫霉菌时，采用NaOH快速裂本文档来自技高网...

【技术保护点】
芋疫霉菌环介导等温扩增检测引物，其特征在于，所述引物包括1对外侧引物PcoF3/PcoB3和1对内侧引物PcoFIP/PcoBIP，其序列为：外侧引物：PcoF3:5’‑ACTCGTCATCCACCTGAGT‑ 3’，PcoB3:5’‑CCACTGCTTGACGTTGTTGA‑ 3’；内侧引物：PcoFIP:5’‑AATCGTGCGGAAACGCTCCTGTGGTTGTGCCAACTCCCT‑ 3’，PcoBIP:5’‑CTAGCAGCTACTACCGTGGTGCCTCTTGGTCCGTCACATCG‑ 3’。

【技术特征摘要】
1.芋疫霉菌环介导等温扩增检测引物，其特征在于，所述引物包括1对外侧引物PcoF3/PcoB3和1对内侧引物PcoFIP/PcoBIP，其序列为：外侧引物：PcoF3:5’-ACTCGTCATCCACCTGAGT-3’，PcoB3:5’-CCACTGCTTGACGTTGTTGA-3’；内侧引物：PcoFIP:5’-AATCGTGCGGAAACGCTCCTGTGGTTGTGCCAACTCCCT-3’，PcoBIP:5’-CTAGCAGCTACTACCGTGGTGCCTCTTGGTCCGTCACATCG-3’。2.利用权利要求1所述引物的芋疫霉菌LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取待测样品基因组DNA；（2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的外侧引物PcoF3/PcoB3和内侧引物PcoFIP/PcoBIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25μL，包括5μM外侧引物PcoF3和PcoB3各1.0μL，40μM内侧引物PcoFIP和PcoBIP...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰成忠，姚锦爱，阮宏椿，吴玮，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35