本发明专利技术属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种与猪生产性状分子标记的克隆及其应用。本发明专利技术克隆得到如序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３所示的与猪生产性状相关的基因片段，其中在ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３的第１９０ｂｐ处有一个Ｔ１９０－Ｃ１９０的碱基突变，导致Ｅｃｏ１３０Ｉ－ＲＦＬＰ多态性。本发明专利技术还公开了获得上述分子标记、引物的制备方法以及利用本发明专利技术克隆的分子标记进行猪生产性状关联分析的方法。本发明专利技术为猪的分子标记辅助选择提供了新的分子标记。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于猪的分子标记辅助选择
，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与生产性状相关的分子标记的克隆及应用，该分子标记与尸A^/尸/ /^基因有关，利用本专利技术克隆的分子标记对猪与生产性状 进行关联分析。
技术介绍
养猪业是我国肉类产品来源的重要支撑产业，在我国畜牧业和国民经济中有着举足轻重的地位。猪的 分子遗传育种在近年来取得了很大的进展，许多影响猪生长性状、胴体性状与肉质性状的新基因被分离克 隆，为现代分子生物技术应用于猪育种提供了分子遗传基础。由肥胖而带来的心血管疾病严重影响人类的 健康，人们越来越关注肉类食品的脂肪含量，因此猪的育种目标由脂肪型向瘦肉型转变。所以分离克隆影 响猪的重要经济性状的新基因，为加速猪新品种的选育、加快我国养猪业的发展具有及其重要的意义。目前，将现代分子生物学与常规育种方法结合所应用最多的领域是标记辅助选择(MAS)与标记辅助导 入(MAI)，它们都是借助分子标记选择某一座位基因来改变该座位基因频率的过程。近几年来，分子标记 有了迅猛的发展，己经从第一代的限制性片段长度多态性标记和第二代的微卫星多态性标记发展到第三代 新型分子标记一单核苷酸多态性(SNP)。 SNP是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性， 包括单碱基的转换、颠换，以及单碱基的插入、缺失等。在特定群体中，某一种碱基即某一等位基因出现 于特定位置的概率要大于1%,此位点才能称之为SNP位点，否则只能称为突变位点。根据SNP在基因组 内的位置可以人为地划分为三种形式第一种是基因编码区的功能突变，主要分布于基因编码区(cording region)，故又称之为cSNP:另外两种是遍布于基因组的大量单碱基变异，包括基因周边SNP(perigenic SNP, pSNP)以及基因间SNP(intergenic SNP, iSNP)。在SNP检测技术上， 一般常用的比较成熟的具有代表性的方法如下l.RFLP.限制性内切酶是一类能识 另ljDNA序列上的特异位点(通常为4 6bp的反向重复序列)，并在特异位点处切割的DNA酶类。对于一条DNA 分子来说会产生特定大小和数目的酶切片段。基因的突变会产生或消除某些酶切位点，从而改变酶切片段 的大小和数目，这些酶切片段可以通过电泳方法检测出来。因此RFLP只适于检测酶切位点处的SNPs，对于 酶切位点以外的SNPs则无法检测。2.SSCP.—定条件下，单链DNA具有一定的折叠结构，这种折叠结构是由 它的核苷酸序列决定的。由于基因突变，DNA分子单链的构像就会发生变化，从而在电场中具有不同的迁 移率，因此可以通过电泳方法检测出来。SSCP的简单易行，仪器要求低，但"差异灵敏度"较低。另外， DNA单链在一定温度下可能有多种热温定性相近的构型，那么电泳时同一条DNA分子就可能产生多个条带' 而且DNA构像对温度的改变非常敏感，所以还需要用别的方法对其进行矫正。随着SNP技术的研究的深入，SNP已经成为进行猪基因与基因组分析的一个重要研究手段，为猪重要经 济性状QTL位点的定位与优良性状的选育提供了强有力的工具，目前已经广泛应用于猪分子育种领域。对 于猪胴体和肉质性状的候选基因，目前已有多例报道。激素敏感脂肪酸(HSL)是动物体内脂肪分解的关键 酶，Harbitz等(1999)对8个梅山X大白祖代群体进行了HSL基因多态性分析表明第7内含子1167处有一个Alu多态性位点，第8外显子存在G—T的碱基变异，它引起谷氨酸一天冬氨酸的变化。胰岛素样生长因子 2 (IGF2)基因是影响猪瘦肉量的主要候选基因。Knoll等(2000)确定了IGF2基因内含子2中G—A的突变 产生了NciI酶切位点。氟烷敏感基因(Hal)是影响猪肉质的主效基因，Fujii等(1991)发现的Hal主要候 选基因I型兰尼定受体基ra (RYRI )存在18处SNPs，其中第1843位突变(C—T)导致蛋白受体第615位的 Arg变为Cys，是导致猪应激敏感综合征(PSS)的原因。猪肌内脂肪(IMF)基因影响肉质的嫩度、风味和 多汁性，心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因主要在心脏、骨骼肌细胞和乳腺细胞表达，可作为影响IMF 含量的候选基因，曹红鹤等(2002)在猪H-FABP基因内发现了3个SNPs: 5'上游区第1324位点T—C突变， 第2内含子1811位点C—G突变，1970位点T—C突变，它们引起了三个变异酶切位点。前人的研究表明，脂肪酶是水溶性的酶，能水解不能溶解的基质，例如甘油二酸酯，磷脂和胆固醇酯。 因此，脂肪酶在脂类代谢和运输中重要作用，同时它和一些严重的疾病例如肥胖，糖尿病和脂肪沉滞性动 脉硬化症等相关联。脂肪酶基肉家族包括肝酯酶，脂蛋白脂肪酶，内皮脂肪酶，磷脂酶A1，胰脂肪酶和 胰脂肪酶相关蛋白l、 2。胰脂酶在体内占优势，胰脂肪酶发挥作用与胰脂肪酶相关蛋白l和2紧密相关。有专家报道胰脂肪酶相关蛋白2 (PNLIPRP2)与酶原颗粒膜相关，这预示着这种酶有可能促进膜结构和 颗粒运输(M.J.Wishartetal 1993)。胰脂肪酶相关蛋白2在胰液中出现，它也参与肠内的脂解作用。当日 粮脂肪含量达到4%时，为了促进脂肪沉积，避免血糖过多而引起糖尿病，TH鼠表现出(一种研究II一糖 尿病的模型动物)选择性地减少PNLIPRP2的表达量(Brown et al 2005)。研究巳证实胰脂肪酶相关蛋白2 对鼠新生儿食物的三酸甘油酯消化起作用。不仅在鼠的小肠组织中能检测到胰脂肪酶相关蛋白2的mRNA， 而且在肠上皮细胞和帕内特细胞内也能检测到。胰脂肪酶相关蛋白2在帕内特细胞内的出现说明了这个酶 既有磷脂酶的活性，也有抗菌活性。对猪的胰脂肪酶相关蛋白2基因的研究在DNA水平上较少，主要集中在蛋白质水平上，而对胰脂肪酶基 因的多态性研究在人类上研究的较多。研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因 功能的一个非常有力的手段。所以申请人对猪胰脂肪酶的部分内含子进行了多态研究和关联分析，以期能 够发现它在猪的选种选育方面的功能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，克隆一种作为猪标记辅助选择的与生产性状(例如胴体性状与 肉质性状)相关的分子标记，并将该分子标记作为猪的标记辅助选择的应用。 本专利技术通过以下技术方案实现申请人克隆得到与猪生产性状(例如胴体性状与肉质性状)相关基因/^VL/P/ F2的DNA片段，它的 cDNA序列(包括全长CDS及部分3，-UTR和部分5'-UTR)如序列表SEQ ID NO: 1所述。同时本专利技术利用上述克隆的DNA片段克隆得到一种作为猪标记辅助选择应用的与猪生产性状相关的 分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 3所示。所述的分子标记，其特征在于序列表SEQ ID NO: 3所示序列的第190位碱基处有一个T190-C190的碱基突变'导致Ecol30 I -RFLP多态性。申请人制备了检测上述碱基突变的正、反向引物'该引物的DNA序列如下所示 正向引物5'-TAGACAAGGCGGAGGATAGC -3'， 反向引物5' - CGTGGGCATCTCTTACAGGC -3'。制备上述分子标记的方法，按照以本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种作为猪标记辅助选择应用的与猪生产性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表ＳＥＱＩＤＮＯ：３所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：熊远著，程蕾，付亚原，任竹青，左波，徐德全，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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