一种重复性DNA的合成与组装方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种重复性DNA的合成与组装方法，该方法包括重复性DNA序列分析；序列拆分与接口选择；引物的设计；DNA片段的合成；重复性DNA的组装：将合成的多个DNA片段、10X T4 DNA Ligase Buffer、T4 DNA 连接酶、II性限制性内切酶以及蒸馏水配置成反应体系，将反应体系进行热循环反应完成重复性DNA产物的组装，其中，热循环的步骤为:37℃反应5分钟；37℃反应3分钟，16℃反应5分钟，该步骤循环进行25次；37℃反应10分钟；50℃反应5分钟；80℃反应5分钟；4℃进行保存。本发明专利技术增加了组装反应可靠性与稳定性；扩展了组装产物的适用范围，使得用该方法可制备重复性DNA的PCR产物文库和重复性DNA的PCR产物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重复性DNA的合成与组装方法及其应用。
技术介绍
DNA合成与组装是合成生物领域中最重要的支撑技术之一，而特殊性的DNA序列，如高GC、低GC、重复性序列等一直都是工业化DNA合成与组装技术开发中的重点与难点。对于重复性DNA序列的合成与组装，现有最常用的方法是基于酶切连接的常规分子克隆方法与GoldenGate无缝组装方法，以及基于同源重组的Gibson组装方法。其中，基于酶切连接的常规分子克隆方法在操作可行性上就受到极大的限制，因为重复性DNA序列中极大可能会没有合适的酶切位点，因此，常规分子克隆技术中的酶切连接方法在越来越多的DNA合成与组装应用中被其他方法取代。鉴于此限制，GoldenGate组装方法得到了开发与应用，因为其消除了上述酶切位点限制，该方法的原理是基于II型限制性内切酶的特征，即切割位点可任意选择，但是识别位点是确定并唯一的，如最最常用的BsaI、BbsI与BsmBI，该方法可不依赖于合成序列中的II性限制性内切酶的存在而使用，在重复性DNA组装过程中有很大优势。但是已经发表的文献中，该方法的操作比较繁琐且构建周期较长，既需要对每个片段进行独立克隆，还需要将每个将供体与载体的抗性进行交叉，这给较长的重复性DNA的合成与组装应用造成了限制；另外，GoldenGate组装方法的供体片段与载体片段都是环状质粒，这给重复性DNA的PCR产物库的合成(因为质粒库有时无法到达PCR产物库的多样性)与重复性DNA合成的PCR产物制备造成了限制，因此，在体外PCR产物库转录等应用中，该方法也有局限性；此外，GoldenGate组装在试剂配置与程序上有多种方法，并且在组装成功率上也有比较大的差异，这也使得其在质粒文库构建中的应用受到了限制。另外，自2009以来，Gibson组装方法得到了广泛的应用，因为其对酶切位点没有任何依赖性，并且也可以同GoldenGate一样实现多片段的一步组装，因此，在基因合成工业中与合成生物学研究领域得到了深入研究与应用，但是Gibson重组是基于体外重组原理的方法，而重复性DNA片段由于很难设计非常合理的重组臂序列，因此，Gibson重组在该类序列合成中也受到了限制。基于同源重组的Gibson组装方法在进行重复性DNA组装的过程中会发生错误的重组与组装，因此，其在重复性DNA合成与组装过程中也受到极大限制。与本专利技术最相似的实现方案是GoldenGate方法，但是本专利技术优化了该方法所使用的试剂体系与反应程序体系，并且可无缝对接组装产物的PCR扩增体系，使得其在重复性DNA文库的PCR扩增制备与重复性DNA的PCR扩增制备中的应用范围得到了扩展。GoldenGate组装方法的试剂体系不唯一，不同的研究者报道的体系有不同，因此，有时候反应的稳定性得不到保障；本专利技术优化了试剂体系与反应程序，使得组装反应的稳定性与成功率提高；GoldenGate组装方法的产物需要进行转化筛选等，最终制备形式是质粒或者质粒文库；本专利技术明确了组装产物的扩增体系与方法，因此拓展了组装产物的最终制备形式，使得其在重复性DNA文库的PCR扩增制备与重复性DNA的PCR扩增制备中得以应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可靠稳定的重复性DNA的合成与组装方法及其应用。为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的一个目的是提供一种重复性DNA的合成与组装方法，该方法包括如下步骤：步骤(1)、重复性DNA序列分析：将需要合成的重复性DNA序列进行酶切位点分析和重复性分析；步骤(2)、序列拆分与接口选择：根据步骤(1)的分析结果，将所述的重复性DNA序列分为多个亚片段，并确定每个所述的亚片段的接口序列；步骤(3)、引物的设计：根据步骤(2)的所述的亚片段和所述的接口序列分别对每个所述的亚片段设计并合成引物；步骤(4)、DNA片段的合成：根据步骤(3)设计并合成的引物进行多个DNA片段的合成；步骤(5)、重复性DNA的组装：将步骤(4)合成的多个DNA片段、10XT4DNALigaseBuffer、T4DNA连接酶、II性限制性内切酶以及蒸馏水配置成反应体系，将所述的反应体系进行热循环反应完成重复性DNA产物的组装，其中，所述的热循环的步骤为：1)、37℃反应4～6分钟；2)、37℃反应2～4分钟，16℃反应4～6分钟，该步骤循环进行22～28次；3)、37℃反应8～12分钟；4)、50℃反应4～6分钟；5)、80℃反应4～6分钟；6)、4℃进行保存。具体地，步骤(1)中，进行重复性DNA序列分析，确保所述的重复性DNA序列内部没有II型限制性酶切位点BsaI、BbsI与BsmBI，同时，找出重复性序列的边界位置，并以此作为步骤(2)中的接口序列选择的依据。若需要合成的重复性DNA序列不符合步骤(1)的要求，则无法采用本专利技术进行合成。具体地，步骤(1)中，采用Lasergene软件套装的genequest模块进行重复性DNA序列分析。具体地，步骤(2)中，亚片段为2～8个；每个所述的接口序列的内部不能出现镜像重复序列，并且，每两个所述的接口序列没有相同的序列，也没有完全反向互补的序列。具体地，步骤(3)中，将步骤2中每一段拆分的序列进行接头序列的添加，以确保II型限制性酶切位点的正确性，并在引物末端序列上添加通用的扩增序列。具体地，步骤(4)中，进行DNA片段合成的方法包括：用长引物作为模板进行通用引物扩增、扩增模板得到、人工基因合成方法获得。具体地，步骤(5)中，所述的反应体系中各组分的用量为：每个DNA片段各18～22ng；10XT4DNALigaseBuffer1.5～2.5μL；T4DNA连接酶0.8～1.2μL；II性限制性内切酶1.3～1.8μL；最后用蒸馏水补足20μL本专利技术的另一个目的是提供一种所述的合成与组装方法组装的重复性DNA在重复性DNA文库的PCR扩增制备与重复性DNA的PCR扩增制备中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种重复性DNA的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：步骤(1)、根据所述的合成与组装方法组装的重复性DNA产物设计上下游引物；步骤(2)、将dNTPs混合物、10xTaqBuffer、上下游引物、所述的合成与组装方法组装的重复性DNA产物、Taq酶配置成反应体系，然后将所述的反应体系进行热循环反应完成重复性DNA的PCR扩增，其中，所述的热循环的步骤为：1)、95℃反应4～6分钟；2)、95℃反应0.8～1.2分钟，58℃反应0.8～1.2分钟，72℃反应1.5～2.5分钟，该步骤循环进行28～32次；3)、72℃反应8～12分钟；4)、4℃进行保存。优选地，所述的反应体系中各组分的用量为：共计40mM的dNTPs混合物0.8～1.2μL、10xTaqBuffer共4.5～5.5μL、浓度各为10mM的上下游引物各1.8～2.2μL、所述的合成与组装方法组装的重复性DNA产物1.8～2.2μL、Taq酶共1.8～2.2μL。由于上述技术方案的实施，本专利技术与现有技术相比具有如下优点：本专利技术公开了一种重复性DNA合成与组装的方法及其试剂配方与反应程序，以及其在重复性DNA的PCR产物扩增与重复性DNA的PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重复性DNA的合成与组装方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：步骤（1）、重复性DNA序列分析：将需要合成的重复性DNA序列进行酶切位点分析和重复性分析；步骤（2）、序列拆分与接口选择：根据步骤（1）的分析结果，将所述的重复性DNA序列分为多个亚片段，并确定每个所述的亚片段的接口序列；步骤（3）、引物的设计：根据步骤（2）的所述的亚片段和所述的接口序列分别对每个所述的亚片段设计并合成引物；步骤（4）、DNA片段的合成：根据步骤（3）设计并合成的引物进行多个DNA片段的合成；步骤（5）、重复性DNA的组装：将步骤（4）合成的多个DNA片段、10X T4 DNA Ligase Buffer、T4 DNA 连接酶、II性限制性内切酶以及蒸馏水配置成反应体系，将所述的反应体系进行热循环反应完成重复性DNA产物的组装，其中，所述的热循环的步骤为：1）、37℃反应4~6分钟；2）、37℃反应2~4分钟，16℃反应4~6分钟，该步骤循环进行22~28次；3）、37℃反应8~12分钟；4）、50℃反应4~6分钟；5）、80℃反应4~6分钟；6）、4℃进行保存。

【技术特征摘要】
1.一种重复性DNA的合成与组装方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：步骤（1）、重复性DNA序列分析：将需要合成的重复性DNA序列进行酶切位点分析和重复性分析；步骤（2）、序列拆分与接口选择：根据步骤（1）的分析结果，将所述的重复性DNA序列分为多个亚片段，并确定每个所述的亚片段的接口序列；步骤（3）、引物的设计：根据步骤（2）的所述的亚片段和所述的接口序列分别对每个所述的亚片段设计并合成引物；步骤（4）、DNA片段的合成：根据步骤（3）设计并合成的引物进行多个DNA片段的合成；步骤（5）、重复性DNA的组装：将步骤（4）合成的多个DNA片段、10XT4DNALigaseBuffer、T4DNA连接酶、II性限制性内切酶以及蒸馏水配置成反应体系，将所述的反应体系进行热循环反应完成重复性DNA产物的组装，其中，所述的热循环的步骤为：1）、37℃反应4~6分钟；2）、37℃反应2~4分钟，16℃反应4~6分钟，该步骤循环进行22~28次；3）、37℃反应8~12分钟；4）、50℃反应4~6分钟；5）、80℃反应4~6分钟；6）、4℃进行保存。2.根据权利要求1所述的重复性DNA的合成与组装方法，其特征在于：步骤（1）中，进行重复性DNA序列分析，确保所述的重复性DNA序列内部没有II型限制性酶切位点BsaI、BbsI与BsmBI，同时，找出重复性序列的边界位置，并以此作为步骤（2）中的接口序列选择的依据。3.根据权利要求1所述的重复性DNA的合成与组装方法，其特征在于：步骤（1）中，采用Lasergene软件套装的genequest模块进行重复性DNA序列分析。4.根据权利要求1所述的重复性DNA的合成与组装方法，其特征在于：步骤（2）中，亚片段为2~8个；每个所述的接口序列的内部不能出现镜像重复序列，并且，每两个所述的接口序列没有相同的序列，也没有完全反向互补的序列。5.根据权利要求1所述的重复性DNA的合成与组装方法，其特征在于：步骤（3）中，将步骤2中每一段拆分的序列进...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟云鹏，徐倩，柳伟强，李彦敏，杨平，
申请(专利权)人：苏州泓迅生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32