体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用技术方案

本发明专利技术涉及一种体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用，按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：5X pre‑assembly buffer35~45%，T5核酸外切酶0.1~0.15%，高保真Taq酶4.5~5.5%，ddH2O50~60%；其中，所述的5X pre‑assembly buffer包括如下配方：占所述的5X pre‑assembly buffer总体积20~30%的聚乙二醇、450~550mM的三（羟甲基）氨基甲烷、45~55mM的MgCl2、45~55mM的二硫苏糖醇、0.9~1.1mM的dNTPs。本发明专利技术的重组酶系统无需使用NAD和Taq DNA连接酶，使得整体成本降低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用。
技术介绍
现代分子生物学在研究基因表达和元件功能时，分子克隆每天都会用到。随着研究基因数量的增加和调控元件序列获取，通过对研究基因的快速克隆进行分析其功能的需求急剧增加。为了满足这一需求，需要选择一种简单、有效、强健、快速且能与任何DNA序列都能进行高通量克隆的方法。目前，已有许多定向克隆及多片段体外组装的方法，包括Gateway，In-fusion，Cold-fusion，T4 DNA polymerase-based Ligase Independent Cloning(LIC)，Golden Gate，Gibson Assembly等，考虑到经济及操作的简易性，成功率等因素，目前，最主要的是Gateway技术，Golden Gate，基于Ⅱ型限制性内切酶的连接方法和Gibson Assembly。Gibson Assembly方案的酶系(2x，800ul)配置如下：比例试剂128ulCBAR buffer1ulExoIII20ulTaq DNA ligase40ulTaq polymerase610ulddH2O其中，CBAR buffer(4X)体系的配置如下：比例试剂20％PEG-8000600mMTris-HCl pH 7.540mMMgCl240mMDTT800mMdNTPs4mMNAD反应温度为一步等温体系，50℃反应15-60min分钟。其中,Gateway技术不依赖限制性内切酶而适用范围广泛，但是由于需要构建入门载体，需要花费大量时间和财力，以及限制DNA片段数量的克隆。Golden Gate适用于多片段基因的组装，然而，它依赖连接酶和Ⅱ型限制性内切酶，此类内切酶长度在6～8bp之间，很容易会出现在需克隆的目的片段序列上；Ⅱ型限制性内切酶的连接方法需要寻找合适的酶切位点，这个需要花费较多精力以及需要相应的限制性内切酶，所花费时间较多，当片段数量多时，需要较长的周期。Gibson Assembly是使用T5外切酶、DNA聚合酶及Taq连接酶而不依赖限制性内切酶点的多段重组方法，反应为一步等温法，这种简单、有效，强健、快速且适用除正向重复以外的DNA片段的组装方法，但是该组装酶价格较高。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种成本低的体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用。为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的一个目的是提供一种体外多段重组酶系统，按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：其中，所述的5X pre-assembly buffer包括如下配方：占所述的5Xpre-assembly buffer总体积20～30％的聚乙二醇、450～550mM的三(羟甲基)氨基甲烷、45～55mM的MgCl2、45～55mM的二硫苏糖醇、0.9～1.1mM的dNTPs。优选地，按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：其中，所述的5X pre-assembly buffer包括如下配方：占所述的5Xpre-assembly buffer总体积23.75～26.25％的聚乙二醇、475～525mM的三(羟甲基)氨基甲烷、47.5～52.5mM的MgCl2、47.5～52.5mM的二硫苏糖醇、0.95～1.05mM的dNTPs。更优选地，按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：其中，所述的5X pre-assembly buffer包括如下配方：占所述的5X pre-assembly buffer总体积24.75～25.25％的聚乙二醇、495～505mM的三(羟甲基)氨基甲烷、49.5～50.5mM的MgCl2、49.5～50.5mM的二硫苏糖醇、0.99～1.01mM的dNTPs。优选地，所述的聚乙二醇为聚乙二醇-8000。优选地，所述的三(羟甲基)氨基甲烷的pH为7.4～7.6。本专利技术中，所述的体外多段重组酶系统为2X体外多段重组酶系统。本专利技术的另一个目的是提供一种如权利要求1至6中任一项所述的体外多段重组酶系统在基因组装中的应用。具体地，所述的基因组装的制备体系包括：19～21μL的ddH2O、9.5～10.5μL的体外多段重组酶系统、线性化克隆载体和插入片段扩增产物，其中，所述的线性化克隆载体和所述的插入片段扩增产物的每片段最适使用量为(0.02×片段碱基对数)ng。更具体地，所述的基因组装的制备体系在冰水浴中配制。更具体地，将所述的基因组装的制备体系在PCR仪器内，在47.5～52.5℃下反应5～60min。由于上述技术方案的实施，本专利技术与现有技术相比具有如下优点：本专利技术的重组酶系统的原料便宜易得，且无需使用NAD，使得整体成本降低，本专利技术的重组酶系统能够一次性组装多个DNA片段到载体上，大大缩短了组装周期，提高了生产效率，使企业在合成生物学领域提高核心竞争力。说明书附图图1为基因组装的流程图；图2为载体酶切后的电泳图；图3为扩增后的电泳图；图4为培养后的平板图；图5为菌检阳性率的图片。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细的说明，但本专利技术并不限于以下实施例。本专利技术中若无特别说明，原料均可市购获得，方法为本领域的常规方法。实施例1：试验流程1、重组酶体系的配置：5X pre-assembly buffer的配置，其配方如表1：表1比例试剂25％(V/V)聚乙二醇-8000(PEG-8000)500mM三(羟甲基)氨基甲烷Tris-HCl(pH 7.5)50mMMgCl250mMDTT1mMdNTPs重组酶系(2X)Mix的配置，其配方如表2：2X Hot fusion Buffer(400ul)表2比例试剂160ul5X pre-assembly buffer0.5ulT5核酸外切酶20ul高保真Taq酶220ulddH2O2.引物设计插入片段扩增引物设计通过在引物5’端引入同源重组序列，扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的完全一致的序列(20bp～25bp)。以pUC57作为克隆载体为例、进行三插入片段顺序拼接克隆(5’至3’按克隆顺序依次为：第一片段、第二片段、第三片段)为例，引物具体设计方案如下：第一段的5’端与pUC57-Amp的EcoRⅠ酶切端有一段20～25bp一致的序列，称为重组臂(overlaps，以下用overlaps指重组臂)，第一段3’端与第二段5’端有20～25bp一致的序列，依次类推。3.制备线性化载体选择合适的酶切位点，并对克隆载体进行线性化，酶切后使用琼脂糖胶回收。GC含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游25bp区域内GC含量均在40％～60％范围之内时，重组效率将达到最高。注：经选用无重复序列但GC含量高或低的区域进行阳性对照，其结果证明对重组效率无明显影响单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。4.插入片段PCR扩增插入片段可用任意PCR酶扩增PCR扩增的反应体系如表3中所示，PCR扩增的反应条件如表4中所示。表3体系组分用量(μL)ddH2O355×PCR buffer1010mM dNTP1template1prime本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外多段重组酶系统，其特征在于：按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：5X pre‑assembly buffer  35~45%，T5核酸外切酶            0.1~0.15%，高保真Taq酶             4.5~5.5%，ddH2O                   50~60%；其中，所述的5X pre‑assembly buffer包括如下配方：占所述的5X pre‑assembly buffer总体积20~30%的聚乙二醇、450~550mM的三（羟甲基）氨基甲烷、45~55mM的MgCl2、45~55mM的二硫苏糖醇、0.9~1.1mM的dNTPs。

【技术特征摘要】
1.一种体外多段重组酶系统，其特征在于：按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：5X pre-assembly buffer 35~45%，T5核酸外切酶 0.1~0.15%，高保真Taq酶 4.5~5.5%，ddH2O 50~60%；其中，所述的5X pre-assembly buffer包括如下配方：占所述的5X pre-assembly buffer总体积20~30%的聚乙二醇、450~550mM的三（羟甲基）氨基甲烷、45~55mM的MgCl2、45~55mM的二硫苏糖醇、0.9~1.1mM的dNTPs。2.根据权利要求1所述的体外多段重组酶系统，其特征在于：按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：5X pre-assembly buffer 37.5~42.5%，T5核酸外切酶 0.1~0.13%，高保真Taq酶 4.7~5.2%，ddH2O 52.2~57.7%；其中，所述的5X pre-assembly buffer包括如下配方：占所述的5X pre-assembly buffer总体积23.75~26.25%的聚乙二醇、475~525mM的三（羟甲基）氨基甲烷、47.5~52.5mM的MgCl2、47.5~52.5mM的二硫苏糖醇、0.95~1.05mM的dNTPs。3.根据权利要求2所述的体外多段重组酶系统，其特征在于：按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：5X pre-assembly buffer ...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭天玮，钟云鹏，胡涛，李彦敏，杨平，
申请(专利权)人：苏州泓迅生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32