一种利于构建长片段DNA的穿梭载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种利于构建长片段DNA的穿梭载体其制备方法和应用，所述的穿梭载体能在酿酒酵母和大肠杆菌中穿梭，其拥有酵母复制起始位点oriV和大肠杆菌复制起始位点ori2，且是低拷贝的复制起始位点，在酵母和大肠杆菌中都可以稳定复制，在酵母中的筛选标签是HIS3，在大肠杆菌中的筛选标签是氯霉素抗性。本发明专利技术所构建的酵母‑大肠杆菌穿梭载体（命名为pSynoYAC0）能够在酵母系统中组装成功，但是酵母中抽提的质粒质量很差，而大肠杆菌中抽提的质粒高，能够满足测序、酶切等进一步的实验需要。该载体在大肠杆菌中也能够复制，且是单拷贝，其复制过程中能够稳定存在，可获得符合要求的载体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利于构建长片段DNA的穿梭载体及其制备方法和应用。
技术介绍
随着基础合成生物学的发展，对生命科学领域的研究需要在体外对复杂通路综合分析，构建新生物元件，重新设计自然生物系统。而现阶段体外组装技术主要有Gateway，In-fusion，Cold-fusion，T4DNApolymerase-basedLigaseIndependentCloning(LIC)，GoldenGate，GibsonAssembly等，目前使用最多的是GibsonAssembly技术，其适用范围广，操作简单、有效，强健、快速，一次能将4段目的片段组装到目标载体，与其他体外组装技术相比，具有更大的优势。而然，该技术最多能完成10kb左右的构建。而随着合成合成生物学的发展，需要对pathway、基因簇甚至于基因组等进行研究，这显然不能满足对其研究的需求。但是，质粒和噬菌体所能携带的外源DNA片段的大小是很有限的。一般来说，Cosmid质粒所能携带的DNA片段不超过45kb。而现在发现的一些大基因，如人类的FaetorVlll基因(180kb)和Dystrophin基因(1800kb)都已远远超过上述载体的克隆容量。这些容量较小的克隆载体，在克隆真核基因组染色体时，遇到了巨大的挑战。Hinnen等在上世纪70年代末就发现报道，酵母自身具有连接作用，能将片段连接起来。Gibson等在2008报道通过酵母体内组装技术完成592kb的质粒，ClydeA.HutchisonIII等经过近30年研究，成功研究出衣原体的最小基因组，运用酵母体内组织技术，组装完成并使其获得活性。由于质粒达到一定量时，在复制拷贝过程中容易缺失、降解，导致无法将构建以质粒的形式存在。酵母体内组装技术是基于重组臂序列，文献报道能实现25个片段的一次性组装到载体，将overlaps设计为80bp，获得全长526kb的质粒构建。用常规的基于重组的方法，如Gibson重组、In-Phusion重组等都无法进行构建。而酵母系统中，组装的片段都较大，需要低拷贝的质粒以保证其稳定性，但是由于酵母有较厚的细胞壁，所提质粒不能满足测序要求。因此，需要开发新的质粒来满足其应用需求。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种单拷贝、能够稳定复制且能够受阿拉伯糖诱导，提高拷贝数，从而获得更高浓度的利于构建长片段DNA的穿梭载体及其制备方法和应用。为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的一个目的是提供一种利于构建长片段DNA的穿梭载体，所述的穿梭载体能在酿酒酵母和大肠杆菌中穿梭，其拥有酵母复制起始位点oriV和大肠杆菌复制起始位点ori2，且是低拷贝的复制起始位点，在酵母和大肠杆菌中都可以稳定复制，在酵母中的筛选标签是HIS3，在大肠杆菌中的筛选标签是氯霉素抗性。具体地，所述的穿梭载体的图谱见图1。具体地，所述的穿梭载体的序列见SEQIDNO.1，其中，n任选为a，c，g，ort。具体地，所述的穿梭载体还包括tonBterminator、T7Teterminator、T7terminator、catpromoter、repE、incC、sopA、sopB、sopC、AmpRpromoter、CEN/ARS、HIS3promoter、cos和loxP。具体地，所述的穿梭载体为环状质粒。具体地，所述的穿梭载体能够受阿拉伯糖诱导本专利技术的另一个目的是提供一种所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体的制备方法，所述的穿梭载体通过基因合成方法合成多个片段，然后将所述的多个片段进行体外重组后，经自身环化制得。优选地，每个所述的片段的长度为0.3～6kb，更优选为0.5～5kb。具体地，通过基因合成方法合成所述的片段的具体方法为：步骤(1)、将每条20pM/ul的引物各加2～10ul，混合后用100ulddH2O稀释，第一轮PCR反应体系为：第一轮PCR反应程序为：步骤(2)、以第一轮PCR反应液为模板，进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增的反应体系为：第二轮PCR扩增的反应程序为：步骤(3)、采用琼脂糖凝胶电泳回收第二轮PCR扩增的产物，将PCR产物平连PUC57-Amp上，酶切位点是ECORV，挑选单克隆进行菌检测序，获得正确克隆后，再用首尾引物PCR扩增条带即得所述的片段。上述，加ddH2O至50微升是指其他原料按用量添加后，加入ddH2O至总体积为50微升。扩增程序中的多个循环的循环次数按照实际需要进行选择。具体地，所述的体外重组的具体方法为：按每个所述的片段100ng的用量将所述的多个片段与5～15ul的Gibson预混液混合，然后用ddH2O加至反应体系总体积20～30ul，然后在42～58℃反应0.5～3h，然后转入Epi300感受态，冰浴15～50min，38～48℃热激60～100s，冰浴1～5min，然后加500ulLB培养基在35～40℃恢复0.5～3h，涂于氯霉素抗性的LB固体培养基，过夜培养，挑选单克隆，选择阳性克隆送测即得所述的穿梭载体。本专利技术中，Gibson预混液为购自NEB公司的货号：#E2611S的产品。本专利技术的第三个目的是提供一种以所述的穿梭载体在酵母体内进行大片段组装的方法，包括如下步骤：步骤(a)、将所述的穿梭载体进行酶切获得线性化质粒，合成多个片段；步骤(b)、将所述的线性化质粒、所述的多个片段与异丙醇等体积沉淀，并加入占所述的线性化质粒、所述的多个片段与所述的异丙醇总体积的5％～20％的NaAc，于零下80℃～零下20℃沉淀30～360min，然后在0～40℃下，以12000～14000转/分钟的转速离心8～12min，丢弃上清液，然后经多次洗涤后，在生物安全柜吹8～12min后用水溶解得到混合液；步骤(c)、将步骤(b)得到的混合液加入酵母电转感受态细胞中，冰上置25～35min，用电转仪电转，用YPD培养基在28～32℃下恢复30-360min；步骤(d)、将经步骤(c)恢复后的菌液离心收集菌体，将所述的菌体经多次洗涤后用山梨醇混匀，然后在带有筛选的平板上涂匀，在28～32℃的恒温培养箱培养2～3d；步骤(e)、在经步骤(d)培养后的平板上挑斑抽提质粒，挑选单克隆于his缺陷型培养基，用酵母试剂盒提取质粒，将获得的质粒进行PCR检测；步骤(f)、将检测到有条带的质粒用Epi300感受态细胞转化到大肠杆菌中，获得单克隆进行菌检，获得阳性条带的菌液。优选地，步骤(a)中，选择ASCI酶切位点或EcoRⅠ酶切位点进行酶切。优选地，步骤(a)中，所述的线性化质粒和所述的片段之间的重组臂、所述的片段与所述的片段之间的重组臂为30～150bps。优选地，步骤(b)中，所述的线性化质粒、每个所述的片段、所述的水的体积比为1：0.6～1.5：5～8。优选地，步骤(b)中，采用质量百分比为60～80％的乙醇水溶液进行洗涤。优选地，步骤(c)中，电转时用电转仪调整SC2真菌电转程序，用电转杯电转。优选地，步骤(d)中，采用0.9～1.1moL/L的山梨醇进行洗涤。由于上述技术方案的实施，本专利技术与现有技术相比具有如下优点：本专利技术所构建的酵母-大肠杆菌穿梭载体(命名为pSynoYAC0)能够在酵母系统中组装成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利于构建长片段DNA的穿梭载体，其特征在于：所述的穿梭载体能在酿酒酵母和大肠杆菌中穿梭，其拥有酵母复制起始位点oriV和大肠杆菌复制起始位点ori2，且是低拷贝的复制起始位点，在酵母和大肠杆菌中都可稳定复制，在酵母中的筛选标签是HIS3，在大肠杆菌中的筛选标签是氯霉素抗性。

【技术特征摘要】
1.一种利于构建长片段DNA的穿梭载体，其特征在于：所述的穿梭载体能在酿酒酵母和大肠杆菌中穿梭，其拥有酵母复制起始位点oriV和大肠杆菌复制起始位点ori2，且是低拷贝的复制起始位点，在酵母和大肠杆菌中都可稳定复制，在酵母中的筛选标签是HIS3，在大肠杆菌中的筛选标签是氯霉素抗性。2.根据权利要求1所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体，其特征在于：所述的穿梭载体的图谱见图1，序列见SEQIDNO.1。3.根据权利要求1所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体，其特征在于：所述的穿梭载体还包括tonBterminator、T7Teterminator、T7terminator、catpromoter、repE、incC、sopA、sopB、sopC、AmpRpromoter、CEN/ARS、HIS3promoter、cos和loxP。4.根据权利要求1所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体，其特征在于：所述的穿梭载体为环状质粒。5.一种如权利要求1至4中任一项所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体的制备方法，其特征在于：所述的穿梭载体通过基因合成方法合成多个片段，然后将所述的多个片段进行体外重组后，经自身环化制得。6.根据权利要求5所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体的制备方法，其特征在于：每个所述的片段的长度为0.3-6kb。7.根据权利要求5所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体的制备方法，其特征在于：通过基因合成方法合成所述的片段的具体方法为：步骤(1)、将每条20pM/ul的引物各加2～10ul，混合后用100ulddH2O稀释，第一轮PCR反应体系为：第一轮PCR反应程序为：步骤(2)、以第一轮PCR反应液为模板，进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增的反应体系为：第二轮PCR扩增的反应程序为：步骤(3)、采用琼脂糖凝胶电泳回收第二轮PCR扩增的产物，将PCR产物平连PUC57-Amp上，酶切位点是ECORV，挑选单克隆进行菌检测序，获得正确克隆后，再用首尾引物PCR扩增条带即得所述的片段。8.根据权利要求5所述的利于构建长片段DNA的穿梭载体的制备方法，其特征在于：所述的体外重组的具体方法为：按每个所述的片段100ng的用量将所述的多个片段与5～15ul的Gibson预混液混合，然后用ddH2O加至反应体系总体积20～30ul，然后在42～58℃反应0.5～3h，然后转入Epi300感受态，冰浴15～50min，38～48℃热激60～100s，冰浴1～5min，然后加5...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭天玮，钟云鹏，李彦敏，杨平，
申请(专利权)人：苏州泓迅生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32