本发明专利技术涉及一种信号放大技术电化学传感器制备方法及应用。首先制备金-铂纳米粒子，并以硫堇为电化学试剂将其固定在金-铂纳米粒子表面，再将探针DNA通过固定在纳米粒子表面，制得电化学探针。同时将发卡DNA自组装在金电极表面得电化学传感器。在电化学传感器上加入目标DNA时，目标DNA与组装在金电极表面表面上的发卡DNA部分互补配对打开发卡结构。然后另外一条发卡DNA链通过竞争作用取代目标链DNA，从而释放目标链DNA。释放的目标链则继续打开电极表面的其他的发卡结构DNA，如此的循环作用实现了目标链DNA的循环使用，结合制备的电化学探针，实现对目标DNA的测定。本发明专利技术的传感器具有很高的选择性和检测灵敏度；金-铂纳米粒子为载体负载硫堇为探针具有电化学稳定的优势。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种信号放大技术电化学传感器制备方法及应用。首先制备金-铂纳米粒子，并以硫堇为电化学试剂将其固定在金-铂纳米粒子表面，再将探针DNA通过固定在纳米粒子表面，制得电化学探针。同时将发卡DNA自组装在金电极表面得电化学传感器。在电化学传感器上加入目标DNA时，目标DNA与组装在金电极表面表面上的发卡DNA部分互补配对打开发卡结构。然后另外一条发卡DNA链通过竞争作用取代目标链DNA，从而释放目标链DNA。释放的目标链则继续打开电极表面的其他的发卡结构DNA，如此的循环作用实现了目标链DNA的循环使用，结合制备的电化学探针，实现对目标DNA的测定。本专利技术的传感器具有很高的选择性和检测灵敏度；金-铂纳米粒子为载体负载硫堇为探针具有电化学稳定的优势。【专利说明】—种信号放大技术电化学传感器检测DNA的方法
本专利技术属于分析化学和电化学
，涉及一种信号放大技术电化学传感器制备方法及应用。另外，本专利技术还涉及采用所述的电化学传感器检测DNA的方法。
技术介绍
检测特定序列DNA在临床诊断、基因治疗以及其他生物医学研究上是十分重要的。因此，建立高灵敏度快速检测特定序列的DNA的方法是十分必要的。一般情况下，检测DNA都是基于DNA杂交来实现的。为了读出杂交反应，通常的方法是对目标DNA的部分互补序列进行标记。一般采用荧光、电化学发光、化学发光物质等标记目标DNA的部分互补序列制得DNA探针，根据杂交反应后DNA探针的信号强度测定目标DNA的浓度。然而，由于生物体系中目标DNA的浓度极低，必须采用适当的检测方法提高传感器的灵敏度。因此，一些基于信号放大的DNA检测方法得到T 发展:酶切循环信号放大技术，滚环放大技术，聚合酶链反应，环介导等温扩增等。这些方法各有其优点，能不同程度的满足对DNA的检测要求，但灵敏度不高。所以必须发展一种灵敏度高，简单，稳定的检测方法。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种信号放大技术电化学传感器制备方法及应用。以及提供一种采用所述的电化学传感器检测DNA的方法。本专利技术的目的是这样实现的:本专利技术是通过以下措施来实现的:一种信号放大技术电化学传感器制备方法，其特征是包括以下步骤:(I)金-钼纳米粒子的制备；(2)电化学探针的制备；(3)电化学传感器的制备；本专利技术所述的金-钼纳米粒子的制备包括以下步骤:把制备和储备金胶溶液所用的玻璃容器(容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶)用王水泡30min，然后用二次水冲洗烘干备用；在1000mL圆底烧瓶中加入50mLlmM的HAuCl4,搅拌加热至沸腾，然后快速加入5mL38.8mM的柠檬酸钠(NaC6H5O7)，溶液变为酒红色时，向溶液中依次加入5mL4.0X IO^moir1的HPtCl6, lSmLlOgL—1的PVP，搅拌加热至沸腾后继续加热2h。溶液由酒红色变为棕褐色，制得AuOPtNPs (金-钼纳米粒子)，转移至棕色瓶，4°C储存备用。本专利技术所述的电化学探针的制备包括以下步骤:首先，取2mL的离心管，加入10 μ L DNAl 和 10 μ L ρΗ8.2，50mM 的 Tris-HCl 缓冲溶液，10 μ L TCEP 反应 lh，用以活化巯基；然后，另取2mL离心管依次加入ImL金-钼纳米粒子和1000 μ L硫堇溶液反应0.5h，使硫堇吸附在金-钼纳米粒子上；将吸附了硫堇的金-钼纳米粒子加入到活化好的巯基DNAl中，放入摇床轻摇反应16h。使巯基DNAl与金-钼纳米粒子连接起来；最后在15000转速下,离心30min,得到红色沉淀，并用IOmM, pH8.0的磷酸缓冲溶液洗漆三次,分散在IOmM,PH8.0的磷酸缓冲溶液中得到DNAl/Th/Au@PtNPs电化学探针，4°C避光保存。本专利技术所述的电化学传感器的制备包括以下步骤:1.金电极的预处理金电极经0.05μπι的α-Α1203抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5min，用高纯氮气吹干；采用三电极系统检测，工作电极为金电极，对电极为钼丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在K3 溶液中，设置电压为O~0.8V，对金电极进行循环伏安(CV)扫描；若氧化还原电流峰在O~1000mV内，则已说明电极表面已被处理好。否则重新处理，直至符合要求为止；测完后，用二次水冲洗电极，吹干电极表面，备用。2.金纳米粒子修 饰金电极制备首先取10 μ L AuNPs (直径15nm)滴涂在金电极表面,得金纳米粒子修饰金电极(AuNPs/GE)，置于避光处自然晾干。3.发卡DNA的预处理取一定量的KT6M的巯基DNA4(或DNA3)于2mL离心管中，置于95°C恒温水浴槽中加热5min，取出后立即置于冰水中冷却Imin即得到发卡DNA。4.电化学传感器的制备取10 μ L上述发卡DNA3滴涂在AuNPs/GE表面，4°C自组装24h ;接着取10 μ LKT4M的巯基乙醇滴于电极表面，反应30min，然后用IOmM的磷酸缓冲溶液冲洗两次，即得电化学传感器。一种利用上述方法制备的电化学传感器检测DNA含量的方法，包括如下步骤:(I)再取10 μ L目标DNA2滴加到电化学传感器的电极表面，37°C下孵育2h后，再取10 μ L发卡DNA4滴加到电极表面。37°C下孵育4h，然后用10mM，pH8.0的磷酸缓冲溶液冲洗两次。最后，取10 μ L制备的电化学探针滴加到电极表面，继续孵育lh。(2)将电极体系插入0.1Μ，ρΗ7.4的磷酸缓冲溶液中，以上述所得金电极为工作电极，Ag/AgCl (饱和KCl)电极为参比电极，钼丝电极为对电极测电信号(Ip/A)，进行DNA的测定专利技术考察了电极表面滴加发卡DNA4后，反应时间(Time/h)对电流强度的影响。如图2所示，氧化峰电流首先随着反应时间的增加而增加，当时间达到4h时，峰电流不再增加，而呈现出保持不变的趋势。选择的最优反应时间是4h。也考察了电化学探针在电极上吸附时间对电流强度的影响，如图3所示，在10到60min内，峰电流随着吸附时间的增加而增加。当吸附时间继续增加时，峰电流基本不再变化。因此，以60min为最优的吸附时间。 本专利技术的显著效果本专利技术研究了不同浓度DNA2与电化学信号强度之间的关系，得到了检测DNA2的标准曲线，线性范围及线性方程。在最优的条件下，目标DNA2的浓度在3.0 X 10-14~2.0 X KT12M范围内与电流强度呈一定的线性关系，其线性回归方程是Ip = 6.6X105C+1.0X10_8(IP是电化学信号强度；C是DNA2的浓度，η = 9)(图4)，线性相关系数R = 0.9991，检测限是0.9 X 10-15Μ (3 σ )。用同5根电极对浓度为2.0X 10_13Μ目标物DNA2分别进行17次测定误差分别为2.9%,2.6%,2.7%,2.9%,2.5%,在测定过程中电极表面均无脱落现象。以金纳米粒子为载体负载硫堇为探针对2.0X 10_13Μ目标物DNA2分别进行17次测定误差分别为9.3%、7.9%,7.7%,3.2%,5.7%的，在测定过程中4根电极表面有脱落现象。表明以金-钼纳米粒子为载体负载硫堇为探针具有稳定性高的特点。【本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种信号放大技术电化学传感器检测DNA的方法，包括以下步骤： (1)电化学探针制备方法其特征在于： (a)取2mL的离心管，加入2～30μL DNA1和2～30μL pH8.2的50mM的Tris‑HCl缓冲溶液和10μL TCEP反应1h，用以活化巯基；然后，另取2mL离心管依次加入1mL金‑铂纳米粒子和100～2000μL硫堇溶液反应0.5h，使硫堇吸附在金‑铂纳米粒子上； (b)将吸附了硫堇的金‑铂纳米粒子加入到活化好的巯基DNA1中，放入摇床轻摇反应16h，使巯基DNA1与金‑铂纳米粒子连接起来；最后在15000转速下，离心30min，得到红色沉淀，并用10mM，pH8.0的磷酸缓冲溶液洗涤三次，分散在1mL10mM的pH8.0的磷酸缓冲溶液中得到DNA1/Th/Au@PtNPs电化学探针； (2)金电极的预处理：金电极经0.2μm，0.03μm，0.05μm的α‑A12O3抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，并在超声波水浴中超声5min，用高纯氮气吹干备用； (3)金纳米粒子修饰金电极制备：首先取2～30μL AuNPs溶液滴涂在金电极表面，得金纳米粒子修饰金电极(AuNPs/GE)，置于避光处自然晾干； (4)发卡DNA的预处理：取一定量的1.0×10‑4M～1.0×10‑7M的巯基DNA4(或DNA3)于2mL离心管中，置于95℃恒温水浴槽中加热5min，取出后立即置于冰水中冷却1min即得到发卡DNA； (5)电化学传感器的制备：取2～30μL上述预处理后的发卡DNA3滴涂在AuNPs/GE表面，4℃自组装24h；接着取10μL10‑4M的巯基乙醇滴于电极表面，反应30min，然后用10mM的磷酸缓冲溶液冲洗两次，即得电化学传感器； (6)标准曲线的绘制：取一组浓度梯度的目标DNA2，分别滴加到电化学传感器上，37℃下孵育2h后，取10μL发卡DNA4滴加到电极表面，37℃下孵育4h，然后用10mM，pH8.0的磷酸缓冲溶液冲洗两次；最后，取10μL制备的电化学探针滴加到电极表面，继续孵育1h；然后利用循环伏安法或DPV测得电流强度，根据目标物浓度与电流强度的关系作图得标准曲线，并根据标准曲线计算线性回归方程； (7)样品测定：将含目标DNA2的样品滴加到电化学传感器上，37℃下孵育2h后，取10μL发卡DNA4滴加到电极表面，37℃下孵育4h，然后用10mM，pH8.0的磷酸缓冲溶液冲洗两次；最后，取10μL制备的电化学探针滴加到电极表面，继续孵育1h；然后利用循环伏安法或DPV测得电流强度，根据电流强度，再利用线性回归方程计算样品中目标DNA2含量。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：混旭，柏莉，刘芳，徐长旺，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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