以多重DNA片段为模板制备RNA或DNA探针的方法技术

本发明专利技术涉及一种以多重DNA片段为模板制备RNA或DNA探针的方法。该方法包括以下步骤：从体外转录的基因特异性cDNA或是基因组中特定基因DNA序列中筛选出多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；以所述多重DNA片段为模板，进行以下反应：加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针；或者加入DNA聚合酶和带有生物素或萤光标记的dUTP进行反应，将dUTP掺入产物，纯化后得到DNA探针。本发明专利技术首次用多重DNA片段作为模板，针对待检测目标序列设计多对引物，并在反向引物5’端加上启动子或RNA聚合酶结合序列，以使最终得到的RNA探针能够全部覆盖靶序列。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸诊断领域，具体涉及一种RNA或DNA探针标记的方法及其应用。
技术介绍
荧光原位杂交技术(Flu或escenceinsituhybridization，FISH)是一种重要的非放射性原位杂交技术，荧光染料标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA或RNA分子杂交，如果被检测的染色体靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而探针可以直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。通过在荧光显微镜下观察荧光信号，以确定与特异探针杂交后结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位，对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。荧光原位杂交技术(FISH)具有很多优点，主要体现在：(1)无需放射性同位素标记，安全性较高；(2)FISH的实验周期短，探针稳定性强；(3)通过多次免疫化学反应，使其杂交信号放大，提高灵敏度，检测的灵敏度接近同位素探针杂交；(4)FISH的分辨率高达3-20Mb；(5)FISH可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的探针，即可以制备成多色探针，因此可以在同一张切片上同时观察几种探针的定位，直接得到它们的相关位置和顺序，加速功能基因定位和生物基因组的研究。FISH技术已经在基因定位、基因作图、基因扩增和缺失的检测、产前诊断、哺乳动物染色体进化研究等领域得到了广泛应用，特别是在肿瘤诊断方面，FISH技术被广泛用于乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤等实体瘤的早期诊断、疗效检测、个体化治疗和预后判断等几个方面。研究表明，一些基因的表达与肿瘤的发生密切相关。荧光原位杂交(FISH)一般是应用DNA探针进行检测，DNA探针可以检测DNA样本(基因组DNA)，也可以检测RNA样本(mRNA或ncRNA)。DNA探针稳定性好，易于保存。RNA探针一般用于检测RNA样本(mRNA或ncRNA)。RNA探针的优点在于是单链探针，杂交效率高，且杂交体较DNA探针稳定。在荧光原位杂交中，可以跟据各自探针的优点及检测目标进行选择。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以多重DNA片段为模板制备RNA或DNA探针的方法，该方法能有效地大量制备特异性强、灵敏度高和稳定性强的RNA或DNA探针，以满足生产FISH肿瘤检测试剂盒的需求。本专利技术所述的以多重DNA片段为模板制备RNA或DNA探针的方法，包括以下步骤：A.从体外转录的基因特异性cDNA或是基因组中特定基因DNA序列中筛选出多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；B.以所述多重DNA片段为模板，进行以下反应：a.加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针；或者b.加入DNA聚合酶和带有生物素或萤光标记的dUTP进行反应，将dUTP掺入产物，纯化后得到DNA探针。探针标记常用的RNA聚合酶包括：T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、T3RNA聚合酶和TrcRNA聚合酶。探针标记常用的DNA聚合酶包括：DNA聚合酶I、DNA聚合酶Klenow片段、TaqDNA聚合酶及其他用于PCR中的DNA聚合酶。根据本专利技术所述的制备RNA或DNA探针的方法的进一步特征，所述的步骤A中，所述筛选包括：查找待检测特定mRNA，或者查找基因组中特定基因DNA序列，排除其它非特异性序列；然后，筛选2-50个无内含子和重复序列特定序列区域，根据需要可选择同源区域序列，作为靶序列。根据本专利技术所述的制备RNA或DNA探针的方法的进一步特征，所述的步骤A中，所述引物设计包括：所选的每个区域各设计至少一对引物，使扩增产物长度为100-1000bp。根据本专利技术所述的制备RNA或DNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶，引物的5'端加上T7启动子序列。根据本专利技术所述的制备RNA或DNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是SP6RNA聚合酶，引物的5'端分别加上SP6启动子序列。根据本专利技术所述的制备RNA或DNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是T3RNA聚合酶，引物的5'端分别加上T3启动子序列。根据本专利技术所述的制备RNA或DNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是TrcRNA聚合酶，引物的5'端分别加上Trc启动子序列。T7启动子序列：5’-TAATACGACTCACTATAG-3′SP6启动子序列：5’-CATACGATTTAGGTGACACTATA-3′T3启动子序列：5’-AATTAACCCTCACTAAAG-3′Trc启动子序列：5’-TGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAAT-3′上述四种RNA聚合酶与相应启动子的组合为同类型的设计，可以替换使用。本专利技术进一步提供了一种快速检测癌症相关的细胞因子的试剂盒。本专利技术所述的快速检测癌症相关的细胞因子的试剂盒包括根据本专利技术所述的方法所制备的RNA或DNA探针。本专利技术是以cDNA序列为模板，利用生物信息学技术，通过与基因文库进行比对而鳞选出来的作为探针标记的模板序列。多重DNA片段是指用2个或以上的DNA片段去涵盖及取代全长基因的cDNA序列，这些针对某个基因的多个DNA片段序列不仅能充分体现该基因的特异性及代表性，而且能避免一些重复序列或同源序列以有针对性地增强探针的特异性。本专利技术首次用多重DNA片段作为模板，针对待检测目标序列设计多对引物，并在反向引物5’端加上启动子或RNA聚合酶结合序列，以使最终得到的RNA探针能够全部覆盖所有靶序列。本专利技术探针制备方法简化了探针制备步骤，大幅度缩短整个实验时间，更重要的是，探针特异性和稳定性更强，降低背景信号，灵敏度更高。在此基础上，本专利技术提供了多种肿瘤初诊快速检测方面的新用途和相关的普遍适用的试剂盒。本专利技术所述的制备RNA或DNA探针的方法能有效地大量制备特异性强、灵敏度高和稳定性强的RNA或DNA探针。用于肿瘤诊断的RNA探针比DNA探针有更多的优势，例如：避免了双链DNA探针在杂交反应中两条链之间易复性的可能性，提高了杂交反应的敏感性；RNA与RNA之间形成的杂交体比DNA-RNA杂交体更稳定；而且，RNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响，因此杂交反应后可用RNA酶处理，以洗脱除去未结合的探针，可降低本底信号，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以多重DNA片段为模板制备RNA或DNA探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.从体外转录的基因特异性cDNA或是基因组中特定基因DNA序列中筛选出多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；B.以所述多重DNA片段为模板，进行以下反应：a.加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针；或者b.加入DNA聚合酶和带有生物素或萤光标记的dUTP进行反应，将dUTP掺入产物，纯化后得到DNA探针。

【技术特征摘要】
1.一种以多重DNA片段为模板制备RNA或DNA探针的方法，其特征在
于，包括以下步骤：
A.从体外转录的基因特异性cDNA或是基因组中特定基因DNA序列中筛
选出多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产
物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；
B.以所述多重DNA片段为模板，进行以下反应：
a.加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，
纯化后得到RNA探针；或者
b.加入DNA聚合酶和带有生物素或萤光标记的dUTP进行反应，将dUTP
掺入产物，纯化后得到DNA探针。
2.根据权利要求1所述的制备RNA或DNA探针的方法，其特征在于，所
述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶，引物的5'端加上T7启动子序列。
3.根据权利要求1所述的制备RNA或DNA探针的方法，其特征在于，所
述RNA聚合酶是SP6RNA聚合酶，引物的5'端分别加上SP6启动子序列。
4.根据权利要求1所述的制备RNA或DNA探针的方法，其特征在于，所
述RNA聚合酶是T3RNA聚合酶，引物的5'端...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐学明，鲁隼，冯俊清，
申请(专利权)人：广州复能基因有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44