【技术实现步骤摘要】
本专利技术设计一种利用单分子水平二次循环扩增技术来实现快速，一步法检测microRNAs (miRNAs)及其试剂盒。
技术介绍
MiRNAs是一类长约18-22个核苷酸的高度保守的内源性非编码RNAs大家族，广泛存在于真核生物中。由于miRNAs可以通过碱基互补和目标信使RNA结合，导致其降解并且抑制蛋白质的合成从而调控转录后基因表达水平。miRNAs具有非常广泛的基因调控表达的功能，在生物体的生长，早期发育，细胞分化，细胞凋亡中扮演着重要的角色，在正常组织和肿瘤组织中的表达显著不同，参与了肿瘤的发生，发展。Northern blot和基因芯片是目前为止最广泛应用的miRNAs检测手段,但是由于miRNAs序列不仅短而且相似度较高，再加上在生物体中含量比较低导致以上两种方法的灵敏度和特异性都不是很理想。最近一些扩增的方法已经应用于miRNAs检测,例如invaderassay, ribozyme amplification,突光定量PCR,以及基于纳米粒子的扩增方法等,其中突光定量PCR由于灵敏度高，可应用性强受到越来越多的关注。然而他的实现需要精确的温度循环控制，这严重的限制了他的进一步推广，再加上由于miRNAs的序列非常短，使得PCR的设计变得非常复杂。最近一些课题组提出利用切刻内切酶或核酸外切酶实现核酸的恒温扩增反应，但是他们或者是对被检测核酸的序列有一定的要求或者灵敏度不高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种miRNAs的二次方循环扩增检测方法，并将其应用于乳腺癌细胞miRNA检测。本专利技术方法不需要昂贵的仪器，不需要复杂的实验操作，...
【技术保护点】
一种miRNAs的二次方循环扩增检测方法，包括以下步骤：步骤一：37℃条件下的标准曲线：取5?8个1.5ml的离心管，分别加入分子信标探针、8个碱基的引物、dNTPs、Bst聚合酶、Nb.BbvCI切刻内切酶、lambda核酸外切酶、BSA、RRI，另外设计5?8个浓度梯度(10fM?100nM)的miRNA样品分别加入到以上离心管中37℃恒温孵育2h；所述的分子信标探针的核苷酸序列为：其5′端的两个碱基有硫代标记，3′端标记有淬灭基团DABCYL，另外还含有Nb.BbvCI切刻酶的切刻位点GCTGAGG(下划线)；靠近5′端第10个碱基处标记有荧光基团FAM；所述的8个碱基的引物的核苷酸序列为：其5′端的两个碱基也是硫代标记。步骤二：荧光仪上进行检测，即可得到不同浓度的miRNA样品对应的荧光强度，荧光仪的设置参数如下：激发和发射狭峰宽度均为5nm，电压PMT?700v，激发波长为490nm，发射波长扫描范围500～600nm，根据荧光强度和miRNA样品浓度可得37℃条件下的检测标准曲线；步骤三：改变步骤一中的反应条件为4℃恒温孵育50h，其它条件不变，可得4℃条件下的检测标准曲线...
【技术特征摘要】
1.一种miRNAs的二次方循环扩增检测方法，包括以下步骤: 步骤一:37°C条件下的标准曲线:取5-8个1.5ml的离心管，分别加入分子信标探针、8个碱基的引物、dNTPs、Bst聚合酶、Nb.BbvCI切刻内切酶、lambda核酸外切酶、BSA、RRI，另外设计5-8个浓度梯度(IOfM-1OOnM)的miRNA样品分别加入到以上离心管中37°C恒温孵育2h ;所述的分子信标探针的核苷酸序列为:2.根据权利要求1所描述的miRNAs的二次方循环扩增检测方法，其特征在于，反应总体积为50 μ L,反应成份的浓度为: 分子信标探针:500ηΜ ； 引物:2μΜ; dNTPs:400μΜ ； Bst聚合酶:16U ； Nb.BbvCI切刻内切酶:15U...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏帆，段瑞雪，陈志飞，左小磊，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。