一种多肽疫苗的筛选评估方法技术

本发明专利技术涉及多肽疫苗技术领域，具体涉及一种多肽疫苗的筛选评估方法，包括如下步骤：选择病原体中和抗原表位多肽序列作为多肽疫苗的序列；将选定的中和抗原表位采用化学方法进行多肽合成，封闭活性基团；将多肽与偶联载体进行偶联，洗脱未偶联的多肽，封闭未偶联的偶联载体，清洗待用；将偶联多肽后的偶联载体装填至蛋白质纯化柱，加入抗体样本，洗脱并收集中和抗体；通过体外微量中和试验的方法，分析捕获的中和抗体的中和滴度。本发明专利技术涉及一种前期已在动物试验中证实具有中和效果的抗原表位肽，评估其是否适合用于人体的多肽疫苗的筛选评估方法。本发明专利技术的筛选评估方法将大大提高多肽疫苗的研发效率，降低研发成本。

Screening and evaluation of a polypeptide vaccine

The present invention relates to the technical field of polypeptide vaccine, in particular relates to a method for screening and evaluation of peptide vaccine, which comprises the following steps: selecting pathogen neutralization epitope peptide sequence as the sequence of peptide vaccine; selected neutralizing epitope peptide synthesis using chemical methods, the active groups will be closed; coupling and coupling of peptide carrier. Unconjugated peptide elution, closed coupling carrier, unconjugated cleaning for use; coupling polypeptide coupling to carrier loaded protein purification column, adding antibody sample, elution and collection and antibody; through the method of in vitro neutralization test, analysis of the neutralization titer of neutralizing antibody capture. The present invention relates to an antigenic epitope peptide that has been confirmed to have neutralizing effect in animal experiments, and to evaluate whether it is suitable for screening and evaluating polypeptide vaccine for human body. The screening and evaluation method of the invention will greatly improve the development efficiency of the polypeptide vaccine and reduce the R & D cost.

【技术实现步骤摘要】
一种多肽疫苗的筛选评估方法
本专利技术涉及多肽疫苗
，具体涉及一种多肽疫苗的筛选评估方法。
技术介绍
多肽疫苗的研发是目前病毒疫苗研发中的一个重要组成部分，在疫苗的研究中，多肽疫苗具有免疫应答能力、安全、反应原性低等优势，是新一代疫苗研究的热点之一。EV71病毒是导致重症手足口病的重要病毒之一，目前多以小鼠和兔等实验动物进行EV71中和抗原表位肽的研究。然而，由于动物与人的免疫系统的差异，基于动物实验的EV71中和表位和多肽疫苗的研究，其结果不能等同于人类对于相同多肽疫苗的反应。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种多肽疫苗的筛选评估方法，用于筛选经动物实验验证的具有中和效果的中和抗原表位或多肽在用于人体前的评估工作。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种多肽疫苗的筛选评估方法，包括如下步骤：（1）多肽序列的选择：选择病原体中和抗原表位多肽序列作为多肽疫苗的序列；（2）中和抗原表位多肽的合成：将选定的中和抗原表位进行多肽合成，封闭活性基团；（3）多肽与偶联载体偶联：将多肽与偶联载体进行偶联，洗脱未偶联的多肽，封闭未偶联的偶联载体，清洗待用；（4）亲和层析：将偶联多肽后的偶联载体装填至蛋白质纯化柱，加入抗体样本，洗脱并收集中和抗体；（5）中和抗体分析：通过体外微量中和试验的方法，分析捕获的中和抗体的中和滴度。本专利技术通过对EV71病毒中和抗原表位SP55、SP70和VP2-28分别通过小鼠和兔作为实验动物进行研究，具有较好的中和效果。将其作为EV71多肽疫苗的备选序列。SP55：PESRESLAWQTATNPCSP70：YPTFGEHKQEKDLEYCVP2-28：AGGTGTEDSHPPYKQ。本专利技术的实验动物不仅限于小鼠和兔体内验证有效的中和抗原表位，还包括其他动物，在不脱离本专利技术构思的前提下任何显而易见的替换均在本专利技术的保护范围之内。优选的，所述步骤（1）具体为：选择EV71病毒C4流行株中和抗原表位SP55、SP70和VP2-28多肽序列作为多肽疫苗的序列。本专利技术选用的病原体不仅限于EV71病毒，还可以为其他病原体（如病毒、细菌、支原体、衣原体和寄生虫等），还包括临床各类疾病等的疫苗研发，在不脱离本专利技术构思的前提下任何显而易见的替换均在本专利技术的保护范围之内。更为优选的，所述步骤（1）中，EV71病毒C4流行株中和抗原表位SP55、SP70和VP2-28多肽序列分别为：SP55：PDSRESLAWQTATNPSP70：YPTFGEHKQEKDLEYVP2-28：AGGTGTEDTHPPYKQ。本专利技术的多肽序列不仅限于上述三条，还可以为很多条，在不脱离本专利技术构思的前提下任何显而易见的替换均在本专利技术的保护范围之内。所述步骤（2）具体为：将选定的中和抗原表位采用化学方法进行多肽合成，封闭巯基等活性基团。本专利技术的多肽合成方法不仅限于化学方法，还可以采用其它多肽合成方法，在不脱离本专利技术构思的前提下任何显而易见的替换均在本专利技术的保护范围之内。优选的，所述步骤（3）包括如下步骤：（3.1）偶联载体预处理：选择琼脂糖珠作为偶联载体，加入双蒸水进行膨胀，再加入双蒸水进行洗涤；（3.2）偶联配基：（3.2.1）配基溶解：将多肽用质量分数为25%、pH为9.0的二甲基甲酰胺溶解；（3.2.2）偶联：将预处理后的琼脂糖珠和溶解后的多肽按体积比0.8-1.2:1的比例混合，在20-40℃温度下孵育14-18h；（3.2.3）洗脱：用质量分数为25%、pH为9.0的二甲基甲酰胺洗脱未偶联的多肽；（3.2.4）封闭：在20-40℃温度下，将洗脱后的琼脂糖珠静置于0.8-1.2mol/L的乙醇胺中3-5h，封闭未偶联的偶联载体；（3.2.5）清洗：用摩尔浓度为0.1mol/L、pH为4.0的醋酸盐缓冲液加0.4-0.6mol/L的NaCl溶液和pH为8.0的tris-HCl缓冲液加摩尔浓度为0.4-0.6mol/L的NaCl溶液循环清洗琼脂糖珠。本专利技术采用的偶联载体不仅限于琼脂糖珠，只要带有偶联基团的载体均可，如磁珠或其它微球等，在不脱离本专利技术构思的前提下任何显而易见的替换均在本专利技术的保护范围之内。优选的，所述步骤（4）包括如下步骤：（4.1）结合：将偶联多肽后的偶联载体装填至蛋白质纯化柱，以丙种球蛋白作为抗体样本，加入纯化柱中，加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤；（4.2）洗脱：用摩尔浓度为0.1mol/L、pH为4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，于收集管中加入0.4-0.6gTris固体试剂；（4.3）收集：重复步骤（4.1）和步骤（4.2），直至收集足够量的抗体；（4.4）平衡：用10K的蛋白超滤管加入13-17mLPBS平衡，在4500-5500rpm转速下离心25-35min，弃掉废液；（4.5）浓缩去盐：将步骤（4.3）收集的抗体加入蛋白超滤管中，在4500-5500rpm转速下离心25-35min，收集超滤膜上方液体为浓缩去盐抗体；重复该步骤，直至全部抗体浓缩去盐。本专利技术采用的抗体样本不仅限于人丙种球蛋白，还包括各类血液制品以及患者的血液类样本，在不脱离本专利技术构思的前提下任何显而易见的替换均在本专利技术的保护范围之内。优选的，所述步骤（4.5）之后还包括步骤（4.6）保存：短时间内用不完的抗体加入无菌甘油至质量分数为45%-55%，于-15～-25℃温度下保存。优选的，所述步骤（5）包括如下步骤：（5.1）病毒TCID50的计算：将Vero细胞接种至96孔板，然后接种EV71病毒，接种7天后观察细胞病变情况，计算EV71病毒的TCID50；（5.2）体外微量中和实验通过体外微量中和试验的方法，分析捕获的中和抗体的中和滴度。优选的，所述步骤（5.1）包括如下步骤：（5.1.1）接种细胞：将含有FBS的DMEM培养基的Vero细胞，用PBS洗三遍，再用2-4mL质量分数为0.2%-0.3%的胰酶消化1.5-2.5min，加入2-4mL含有FBS的DMEM培养基，吹打制成单细胞悬液，800-1200rpm转速下离心4-6min，弃掉上清，加入含有FBS的DMEM培养基，吹打制成单细胞悬液，并用细胞计数板计数；用含有FBS的DMEM培养基将细胞稀释成1.5×104-2.5×104个细胞/100μL，并接种至96孔板，过夜培养；（5.1.2）接种病毒：将培养的EV71病毒经过0.20-0.25μm滤膜过滤，用含有FBS的DMEM培养基将EV71病毒按照10-1~10-15梯度稀释；将EV71病毒接种至步骤（5.1.1）中的96孔板，每孔接种100μL，每个梯度接种10个孔；（5.1.3）计算：病毒接种7天后观察细胞病变情况，计算EV71病毒TCID50；所述含有FBS的DMEM培养基中，FBS的质量分数为1.5%-2.5%。优选的，所述步骤（5.2）包括如下步骤：（5.2.1）将Vero细胞按每孔1.5×104-2.5×104个细胞/100μL接种到96孔板，生长过夜；（5.2.2）用含有FBS的DMEM培养基稀释病毒至TCID50为100，取新96孔板，每孔加入EV71病毒50μL；（5.2.3）用含有FBS的DMEM培养基按倍比稀释浓缩去盐抗体，将不同稀释比例的抗体按50μL/孔加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）多肽序列的选择：选择病原体中和抗原表位多肽序列作为多肽疫苗的序列；（2）中和抗原表位多肽的合成：将选定的中和抗原表位进行多肽合成，封闭活性基团；（3）多肽与偶联载体偶联：将多肽与偶联载体进行偶联，洗脱未偶联的多肽，封闭未偶联的偶联载体，清洗待用；（4）亲和层析：将偶联多肽后的偶联载体装填至蛋白质纯化柱，加入抗体样本，洗脱并收集中和抗体；（5）中和抗体分析：通过体外微量中和试验的方法，分析捕获的中和抗体的中和滴度。

【技术特征摘要】
1.一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）多肽序列的选择：选择病原体中和抗原表位多肽序列作为多肽疫苗的序列；（2）中和抗原表位多肽的合成：将选定的中和抗原表位进行多肽合成，封闭活性基团；（3）多肽与偶联载体偶联：将多肽与偶联载体进行偶联，洗脱未偶联的多肽，封闭未偶联的偶联载体，清洗待用；（4）亲和层析：将偶联多肽后的偶联载体装填至蛋白质纯化柱，加入抗体样本，洗脱并收集中和抗体；（5）中和抗体分析：通过体外微量中和试验的方法，分析捕获的中和抗体的中和滴度。2.根据权利要求1所述的一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：所述步骤（1）具体为：选择EV71病毒C4流行株中和抗原表位SP55、SP70和VP2-28多肽序列作为多肽疫苗的序列。3.根据权利要求2所述的一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：所述步骤（1）中，EV71病毒C4流行株中和抗原表位SP55、SP70和VP2-28多肽序列分别为：SP55：PDSRESLAWQTATNPSP70：YPTFGEHKQEKDLEYVP2-28：AGGTGTEDTHPPYKQ。4.根据权利要求1所述的一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：所述步骤（3）包括如下步骤：（3.1）偶联载体预处理：选择琼脂糖珠作为偶联载体，加入双蒸水进行膨胀，再加入双蒸水进行洗涤；（3.2）偶联配基：（3.2.1）配基溶解：将多肽用质量分数为25%、pH为9.0的二甲基甲酰胺溶解；（3.2.2）偶联：将预处理后的琼脂糖珠和溶解后的多肽按体积比0.8-1.2:1的比例混合，在20-40℃温度下孵育14-18h；（3.2.3）洗脱：用质量分数为25%、pH为9.0的二甲基甲酰胺洗脱未偶联的多肽；（3.2.4）封闭：在20-40℃温度下，将洗脱后的琼脂糖珠静置于0.8-1.2mol/L的乙醇胺中3-5h，封闭未偶联的偶联载体；（3.2.5）清洗：用摩尔浓度为0.1mol/L、pH为4.0的醋酸盐缓冲液加0.4-0.6mol/L的NaCl溶液和pH为8.0的tris-HCl缓冲液加摩尔浓度为0.4-0.6mol/L的NaCl溶液循环清洗琼脂糖珠。5.根据权利要求1所述的一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：所述步骤（4）包括如下步骤：（4.1）结合：将偶联多肽后的偶联载体装填至蛋白质纯化柱，以丙种球蛋白作为抗体样本，加入纯化柱中，加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤；（4.2）洗脱：用摩尔浓度为0.1mol/L、pH为4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，于收集管中加入0.4-0.6gTris固体试剂；（4.3）收集：重复步骤（4.1）和步骤（4.2），直至收集足够量的抗体；（4.4）平衡：用10K的蛋白超滤管加入13-17mLPBS平衡，在4500-5500rpm转速下离心25-35min，弃掉废液；（4.5）浓缩去盐：将步骤（4.3）收集的抗体加入蛋白超滤管中，在4500-5500rpm转速下离心25-35min，收集超滤膜上方液体为浓缩去盐抗体；重复该步骤，直至全部抗体浓缩去盐。6.根据权利要求5所述的一种用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘倩，陆小梅，彭琪，蒋再学，谢明玉，
申请(专利权)人：东莞市儿童医院，东莞市儿科研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44