一种叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的定量检测方法技术

本发明专利技术提供了一种叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的定量检测方法，基于抗原和抗体的特异性结合采用间接竞争酶联免疫法达到检测抗原或抗体的目的；且利用酶标二抗放大检测信号的作用，从而提高了实验分析的灵敏度。步骤包括：制备SiO2‑FO包被抗原和免疫原，将免疫原注射到动物体内得到高特异性抗体，然后建立间接竞争酶联免疫法对SiO2‑FO的含量进行了检测分析。本发明专利技术检测方法快速准确、操作简单、检测限低、可进行高通量测定。

【技术实现步骤摘要】
一种叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的定量检测方法
本专利技术涉及纳米材料的定量检测，具体涉及一种叶酸功能化二氧化硅(SiO2-FO)靶向纳米药物载体的定量检测方法。
技术介绍
恶性肿瘤严重威胁着人类的健康。在癌症的治疗中，药物治疗是一个很重要的环节，抗癌药物的有效使用可以帮助患者获得更长的生存时间。抗癌药物的研发一直是科学家关注的焦点之一，但是许多抗癌药物的溶解性低、稳定性差、易被快速代谢和清除、有副作用、缺少靶向功能等，在治疗的过程中很难充分发挥药效，已逐渐不能满足临床用药的需求。因此，无论是从人类健康，还是从社会发展的角度，发展新的技术和手段实现肿瘤有效治疗具有十分重要的意义。随着纳米技术的发展，以及各学科间的交叉融合，具有特殊物理化学性质的纳米材料在肿瘤的治疗方面显示出广阔的应用前景。近年来，肿瘤靶向药物载体系统成为众多学者研究的热点。靶向纳米药物载体的突出优点在于：①控制药物进入特定的靶器官或靶细胞，靶向输送药物；②缓释药物，延长药物作用时间；③提高制剂的稳定性及口服生物利用度；④载体材料可生物降解，无毒或毒性较低。理想的药物载体还应具有载药量大、在体内有一定的循环时间等特点。无机纳米材料作为药物载体具有更高的药物包载率，更好的化学稳定性和生物相容性，因而更适合作为药物载体。在众多的无机纳米材料中，介孔二氧化硅(SiO2)纳米颗粒具有大的比表面积、大的介孔体积、良好的生物相容性，并且表面易修饰等特点，因而将其作为药物载体具有诱人的应用潜力和广阔的应用前景。叶酸(FA)是一种小分子维生素，与其他靶向分子如单克隆抗体相比，FA相对分子质量小、无免疫原性、价廉易得、稳定性好、与药物或载体之间的化学键合简单易行，且FA受体在多数肿瘤细胞膜表面过度表达，通常比正常细胞系高出20～200倍。利用FA的靶向性及其与FA受体的特异性，将FA修饰到SiO2纳米材料上作为靶向纳米药物载体，与FA复合物相比，FA修饰的纳米递药系统具有易于解离释放药物，可穿过生物屏障发挥药效等优点，尤其FA分子暴露在最外面，从而能最充分地接触肿瘤细胞。因此叶酸功能化二氧化硅(SiO2-FO)作为靶向药物载体在医药领域具有广阔的应用前景。纳米生物技术是生物
的前沿和热点问题，从现有研究结果来看，对于纳米材料应用于医学领域通常局限于考察其在体内的分布、降解、药物释放效率以及毒性研究等方面。众所周知，纳米材料因其特殊的效应对人体可能有一定的影响，不同的剂量可能对机体产生不同的功效或副作用。因此，纳米药物载体的剂量检测对于考察该材料是否可以应用于临床显得尤为重要。而目前对于纳米材料的表征方法主要集中在其结构、成分、粒度、形貌以及界面等分析。而对于纳米材料的定量分析还不是很多，目前常用的方法有电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)以及气相色谱-电感耦合等离子体质谱法(GC-ICP-MS)，然而这些方法不仅操作繁琐，仪器昂贵，而且稳定性和灵敏度都不高，检测技术仍不够成熟。因此，对于纳米载体本身在生物体内的定量检测仍是一项十分必要且具有挑战性的工作。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种叶酸功能化二氧化硅(SiO2-FO)靶向纳米药物载体的定量检测方法。利用抗原抗体的特异性结合采用间接竞争酶联免疫法从而实现了对SiO2-FO含量的快速检测。该方法具有快速准确、操作简单、检测限低、可进行高通量测定等特点。一种叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的定量检测方法，所述方法包括以下步骤：a、SiO2-FO包被抗原和免疫原的制备；b、抗SiO2-FO抗体的制备；c、将SiO2-FO包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中，封闭、加入不同浓度的SiO2-FO标准品，以抗SiO2-FO抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体作为二抗，建立间接竞争酶联免疫分析法定量检测SiO2-FO；d、以SiO2-FO标准品浓度的对数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，从而定量检测出SiO2-FO的浓度。所述标准曲线的线性方程为A＝0.8535-0.1083logC，其中A为490nm处的吸光度值，C为SiO2-FO浓度。其相关系数R＝-0.9994，线性范围为10-2-104ng/mL，检出限为0.006ng/mL。所述过程a具体包括以下步骤：a-1、将SiO2-FO溶于PBS溶液中，得到水溶性的SiO2-FO溶液；a-2、将OVA溶于PBS溶液中，然后加入步骤a-1得到的SiO2-FO溶液和戊二醛溶液，25～28℃下避光搅拌2～5h；将反应液置于透析袋中透析24h即可得到SiO2-FO包被抗原；a-3、将BSA溶于PBS溶液中，然后加入步骤a-1得到的SiO2-FO溶液和戊二醛溶液，25～28℃下避光搅拌2～5h；将反应液置于透析袋中透析24h即可得到SiO2-FO免疫原。进一步地，所述步骤a具体包括以下步骤：a-1、称取10～20mgSiO2-FO溶于1～2mLPBS溶液中，磁力搅拌1～2h即得到水溶性的SiO2-FO溶液；a-2、称取10～20mgOVA溶于2～4mLPBS溶液中,并在搅拌下加入步骤a-1得到的SiO2-FO溶液，混合均匀后再滴加80～200μL25％戊二醛溶液，25～28℃下避光搅拌2～5h；将反应液置于透析袋中，用PBS透析24h后收集即可得到SiO2-FO包被抗原，其浓度为2～4mg/mL；a-3、称取10～20mgBSA溶于2～4mLPBS溶液中，并在搅拌下加入步骤a-1得到的SiO2-FO溶液，混合均匀后再滴加80～200μL25％戊二醛溶液，25～28℃下避光搅拌2～5h；将反应液置于透析袋中，用PBS透析24h后收集即可得到SiO2-FO免疫原，其浓度为2～4mg/mL。所述步骤a-2和a-3中，透析袋的截留分子量为8000～14000Da。水溶性的SiO2-FO溶液浓度为5～15mg/mL。所述步骤b具体包括以下步骤：b-1、首次免疫：将SiO2-FO免疫原与弗氏完全佐剂等体积比混合后，采用背部皮下多点注射的方式注射到大白兔体内，注射8～10个点，注射量为1～2mL/只；首次免疫三周后进行加强免疫；b-2、加强免疫：将SiO2-FO免疫原与弗氏不完全佐剂等体积比混合后，采取同样的方式注射到大白兔体内，注射8～10个点，注射量为1～2mL/只；此后每两周进行再次加强免疫，中间周进行耳静脉采血测血清效价，直到效价达到1:64000，再进行最后一次加强免疫，并在免疫一周后从动物颈动脉采血，静置析出抗血清并进行纯化，得到抗SiO2-FO抗体，其浓度为5～10mg/mL。所述步骤c具体包括以下步骤：c-1、包被：用包被缓冲液将SiO2-FO包被抗原稀释1000倍，包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃冰箱过夜；c-2、封闭：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3～5min，洗去未被结合上的SiO2-FO包被抗原，加入1wt％酪蛋白，每孔200μL进行封闭，37℃烘箱温育1～2h；c-3、加样竞争：甩干，PBST溶液洗涤3次，每次3～5min，洗去多余的封闭液，然后将50μL不同浓度的SiO2-FO标准品和50μL抗SiO2-FO抗体分梯度加入各孔中，使之发生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：a、SiO2‑FO包被抗原和免疫原的制备；b、抗SiO2‑FO抗体的制备；c、将SiO2‑FO包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中，封闭、加入不同浓度的SiO2‑FO标准品，以抗SiO2‑FO抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体作为二抗，建立间接竞争酶联免疫分析法定量检测SiO2‑FO；d、以SiO2‑FO标准品浓度的对数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，从而定量检测出SiO2‑FO的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：a、SiO2-FO包被抗原和免疫原的制备；b、抗SiO2-FO抗体的制备；c、将SiO2-FO包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中，封闭、加入不同浓度的SiO2-FO标准品，以抗SiO2-FO抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体作为二抗，建立间接竞争酶联免疫分析法定量检测SiO2-FO；d、以SiO2-FO标准品浓度的对数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，从而定量检测出SiO2-FO的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的线性方程为A＝0.8535-0.1083logC，其中A为490nm处的吸光度值，C为SiO2-FO浓度。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过程a具体包括以下步骤：a-1、将SiO2-FO溶于PBS溶液中，得到水溶性的SiO2-FO溶液；a-2、将OVA溶于PBS溶液中，然后加入步骤a-1得到的SiO2-FO溶液和戊二醛溶液，25～28℃下避光搅拌2～5h；将反应液置于透析袋中透析24h即可得到SiO2-FO包被抗原；a-3、将BSA溶于PBS溶液中，然后加入步骤a-1得到的SiO2-FO溶液和戊二醛溶液，25～28℃下避光搅拌2～5h；将反应液置于透析袋中透析24h即可得到SiO2-FO免疫原。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤a具体包括以下步骤：a-1、称取10～20mgSiO2-FO溶于1～2mLPBS溶液中，磁力搅拌1～2h即得到水溶性的SiO2-FO溶液；a-2、称取10～20mgOVA溶于2～4mLPBS溶液中,并在搅拌下加入步骤a-1得到的SiO2-FO溶液，混合均匀后再滴加80～200μL25％戊二醛溶液，25～28℃下避光搅拌2～5h；将反应液置于透析袋中，用PBS透析24h后收集即可得到SiO2-FO包被抗原，其浓度为2～4mg/mL；a-3、称取10～20mgBSA溶于2～4mLPBS溶液中，并在搅拌下加入步骤a-1得到的SiO2-FO溶液，混合均匀后再滴加80～200μL25％戊二醛溶液，25～28℃下避光搅拌2～5h；将反应液置于透析袋中，用PBS透...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明翠，夏濛，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34