免疫标记复合物的形成方法及用途技术

本发明专利技术一般涉及用于形成免疫标记复合物的方法，所述免疫标记复合物包括标记的单价生物素结合的组合物。本发明专利技术还涉及抗原‑报道分子复合物用于检测样品中靶标的用途。

Method for forming immune marker complex and use thereof

The present invention generally relates to a method for forming an immune marker complex comprising a labeled univalent biotin binding composition. The invention also relates to antigen reported molecular complexes used for target detection in a sample.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】免疫标记复合物的形成方法及用途
本专利技术一般涉及用于形成免疫标记复合物的方法，所述免疫标记复合物包括标记的单价生物素结合的组合物。本专利技术还涉及抗原-报道分子复合物用于检测样品中靶标的用途。
技术介绍
在免疫标记中，抗体用于检测生物和非生物样品中的分子。抗体是通过其抗原结合位点以高特异性结合至抗原（靶分子）的免疫球蛋白（Ig）蛋白。通常，靶分子是蛋白质，但可以是任何免疫原性试剂，例如多糖，脂质，毒素等。结合至抗原的目标分子的一部分成为（抗原）表位。用于免疫标记的抗体可以是多克隆或单克隆（抗体）。多克隆抗体是识别一个靶分子的多个（抗原）表位的抗体的不均匀混合物，而单克隆抗体对单个（抗原）表位显示特异性。通常，单克隆抗体产生更多特异性的免疫标记信号。免疫标记可以是直接或间接的。直接法是一步标记的方法，并且包含用报道分子标记的一抗。报道分子（标记）是可以产生信号的分子，例如酶或荧色物（下文进一步描述）。当标记的一抗被添加到样品中时，其结合并揭示靶分子的位置和/或量。由于直接方法使用仅和样品的一个培育步骤，因此，它简单快速。间接法是两步标记方法，其导致信号扩增。它包含一抗结合至样品中的靶分子（第一步）和标记的二抗结合至已结合的一抗（第二步）。由于多个标记的二抗分子与每个一抗分子结合，与直接法相比，报道信号将被扩增。然而，间接法需要一个额外的培育步骤，并且二抗需要仔细调整至一抗。通常针对动物物种的Ig类产生二抗，动物物种的Ig类中产生一抗。例如，如果一抗是小鼠IgG抗体，则二抗是抗小鼠IgG抗体。如果一抗是兔IgG，则二抗是抗兔IgG等。链霉亲和素（或亲和素的其他衍生物）也可以通过使用生物素化抗体的间接法用于免疫标记中。生物素化抗体是与生物素分子（通常为3-10个生物素分子/抗体分子）共轭的抗体。链霉亲和素与生物素强力结合，因此可用作生物素化抗体的第二试剂。在一些应用中，当样品的性质为可塑的，例如活细胞的膜，常规的链霉亲和素可以引起抗体的聚集。这是因为每个链亲和素分子具有四个生物素结合位点，当作为第二试剂加入时，它可以结合在样品中“漂浮”的多个生物素化的抗体。为了避免这种现象，已经设计了单价形式的链霉亲和素（HowarthMetal,Naturemethods,2006）。单价链霉亲和素具有一个生物素结合位点。因此，它可以用作第二试剂以使生物素化的抗体可视化，生物素化的抗体结合至活细胞膜中的靶分子而没有抗体聚集的风险。用于免疫标记的报道分子根据检测方法的性质而变化。它们直接附着（共轭）至一抗（直接法）或至二抗/链霉亲和素（间接法）。报道分子通过导致报道分子和抗体之间的共价键的化学反应共轭至抗体。因此，报道分子和抗体成为一个单元。通常，多个报道分子共轭至每个抗体分子。最常见的报道分子为用于显色检测的酶或用于荧光信号的荧色物。其他实例为颗粒（例如金颗粒，量子点），磷光化合物（例如碳氰酸染料），放射性化合物（例如3H或32P标记的分子）和过渡金属（用于质谱）。对于某些类别的报道分子，如荧色物和过渡金属，可以在一个样品内同时分离和分析多个信号。这意味着可以在一个样品内同时免疫标记和检测多种不同的靶分子。该多重免疫标记技术例如通常用于荧光显微镜和流式细胞术。由于报道元件的选择在实验/应用之间变化，因此非常希望在抗体上转换报道分子。然而，在直接法中，报道分子和抗体作为一个单元牢固地彼此附着。因此，如果新的报道分子是优选的，则必须获得新的报道分子-抗体单元，而不是改变报道分子。在这个意义上，间接法更灵活，因为报道分子附着至二抗。因此，可以通过用不同报道分子在二抗之间切换来改变报道分子。然而，如上所述，该技术需要与样品进行额外的培育步骤。此外，二抗的使用引起抗体交叉结合的问题，即二抗不仅结合其旨在结合的一抗，而且还结合其他不希望的抗体。这些其他抗体可以是1）组织内的内源性抗体，2）其他一抗，和3）其他二抗。该问题产生于二抗结合来自相同动物物种的所有抗体。因此，每种一抗需要具有不同的抗体类别（动物物种），并且每种二抗必须仅选择性地识别这些类别之一。另外，二抗都不能是任何其他二抗识别的抗体类别。这是本领域众所周知的问题，并且极大地限制了可以在多重免疫标记中组合的抗体的数量。另一种方法是预先形成一抗和二抗之间的复合物，然后将该复合物用于直接免疫标记法。然而，混合一抗和二抗导致抗体聚集，因为抗体具有两个（抗原）表位结合位点。为了避免形成抗体聚集，可以使用单价二抗。然而，在抗体之间形成复合物需要将二抗调整至每一种一抗的动物物种。此外，由于抗体之间的结合不是那么强，所以复合物是不稳定的，并且需要阻断剂，用于隔离游离活性二抗。阻断剂（部分抗体缺少表位结合位点）也需要调整，以致其源于与一抗相同的动物物种。尽管有一些基于二抗的方法，提供了在报道分子之间灵活切换，但当使用直接免疫标记方法时，直接标记的抗体仍然是优选的。因此，将附着报道分子至一抗用于直接免疫标记法的强大而简单的方法是非常需要的。
技术实现思路
本专利技术涉及使用生物素“点击化学”连接报道元件至抗体的方法。报道分子单元由单价形式的生物素结合组合物组成，一个或多个报道元件与其连接。抗体单元由生物素化抗体组成。两个分开的单元可以轻松地通过点击化学连接成免疫标记复合物，免疫标记复合物包含抗体功能和报道元件功能，因此，与直接共轭的抗体具有相同的功能。本专利技术的优点包括：抗体功能和报道元件功能从一开始就是分开的单元，并且它们可以通过简单混合形成非常稳定的复合物。此外，该方法不依赖于抗体的抗体类别。一起，这创建了一个灵活和简单的系统来附着各种报道元件至抗体。重要的是，标记的抗体随后可用于直接免疫标记方法（一步法）。此外，使用点击化学与常规共轭化学相比的优点包括：快速，不需要额外的反应性化学品，不形成副产物（产品立马使用），并且试剂的量和浓度可以从非常低改变到非常高。这些特征使得本专利技术的方法适合于“在实验台上”的小规模共轭以进行大规模共轭以用于分布。根据本专利技术的一个方面，至少部分地通过形成（稳定的）免疫标记复合物的方法实现上述目的，其中，所述方法包括：选择第一生物素化的一抗，选择第一单价生物素结合的组合物，所述组合物标记有第一报道元件，以及在反应容器中，混合第一生物素化的一抗与第一标记的单价生物素结合的组合物。如上所述，可以使用生物素化的一抗和常规链霉亲和素在样品的免疫标记期间实现扩增。然而，这种方法必须分两步进行，因为常规链霉亲和素包含四个生物素结合位点，因此只能用于结合固相（如固定组织样品）的生物素化抗体。在液相中向生物素化抗体添加常规链霉亲和素具有快速聚集成大抗体复合物的非常不利的效果。然而，根据本专利技术，代替使用单价生物素结合组合物，其中仅有一个生物素的功能结合位点，从而避免了在液相（在反应容器中）中混合步骤期间的抗体聚集。因此，单价生物素结合组合物不用作二级标记试剂，而是作为报道分子的载体与生物素化抗体形成稳定的复合物，用作直接共轭的抗体。应当理解，样品不同于第一生物素化的一抗。此外，该方法允许更多的报道元件分子连接到每个抗体分子，而不是将报道元件直接共轭至抗体。因此，该方法可以用于产生比直接共轭的抗体更强的信号。此外，当使用单价生物素结合组合物，如单价链霉亲和素，以形成免疫标记复合物时，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫标记复合物的形成方法，其特征在于，所述方法包括：‑ 选择第一生物素化的一抗；‑ 选择第一单价生物素结合的组合物，所述组合物标记有第一报道元件；以及‑ 在反应容器中，混合第一生物素化的一抗与第一标记的单价生物素结合的组合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.21 SE 1550048-1;2015.05.20 SE 1550640-51.一种免疫标记复合物的形成方法，其特征在于，所述方法包括：-选择第一生物素化的一抗；-选择第一单价生物素结合的组合物，所述组合物标记有第一报道元件；以及-在反应容器中，混合第一生物素化的一抗与第一标记的单价生物素结合的组合物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，混合第一生物素化的一抗与第一标记的单价生物素结合的组合物使得第一报道元件附着至第一生物素化的一抗。3.根据权利要求1和2中任意一项所述的方法，其特征在于，免疫标记复合物随后用于与样品接触。4.根据权利要求1和2中任意一项所述的方法，其特征在于，进一步包括：-将免疫标记复合物与样品接触。5.根据前面权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，所述样品不同于第一生物素化的一抗。6.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，免疫标记复合物随后用于与样品接触，所述样品不同于第一生物素化的一抗。7.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：-提供使用免疫标记复合物免疫标记样品的指示。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，选择第一生物素化的一抗和选择第一单价生物素结合的组合物跟混合第一生物素化的一抗与第一标记的单价生物素结合的组合物分开执行。9.根据前面权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，第一标记的单价生物素结合的组合物基于链霉亲和素、亲和素、traptavidin、captavidin、tamavidin、bradavidin、中性亲和素和rhizavidin中的至少一种。10.根据前面权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：在第一免疫标记复合物形成之后，加入阻断剂以阻断单价生物素结合的组合物的未结合部分。11.根据前面权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，所述报道元件选自包括荧色物、酶、肽、量子点和过渡金属的组。12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，第一单价生物素结合的组合物与报道元件共轭。13.根据前面权利要求中任意一项所述的方法，其特征在于，选择第一单价生物素结合的组合物和第一生物素化的一抗之间的比例使得第一单价生物素结合的组合物阻断第一生物素化的一抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：佩尔·福格尔斯特兰德，乌尔夫·伊瑞里德，
申请(专利权)人：克罗姆尼贡公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE