一种测定三聚氰胺的DNA标记的免疫传感器的构建方法，属于免疫PCR领域。本发明专利技术包括：DNA-三聚氰胺抗体偶联物的制备，三聚氰胺包被抗原包被PCR管，三聚氰胺免疫传感器的构建。本发明专利技术提供一种DNA-三聚氰胺抗体偶联物，经过免疫识别与DNA的荧光定量PCR扩增，通过扩增后的荧光信号对三聚氰胺进行检测。本发明专利技术方法能实现对三聚氰胺超灵敏检测，检测限低、检测灵敏度高、特异性好，为痕量三聚氰胺药物的检测提供了一种有效的方法。
【技术实现步骤摘要】
一种测定三聚氰胺的DNA标记的免疫传感器的构建方法，属于免疫PCR领域。
技术介绍
三聚氰胺(Melamine，MEL)俗称密胺、蛋白精，是一种三嗦类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料，广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。三聚氰胺对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。然而由于三聚氰胺具有很高的含氮量，食品工业常用凯氏定氮法测定氮总量来估算蛋白质的含量，因此三聚氰胺常被不法商人用作食品和饲料的添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标。2008年10月8日，卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临时管理值:婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1.0mg/kg，液态奶(包括原料乳)、奶粉、其它配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg(L)。含乳15%以上的其它食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg(L)，高于以上限量值的产品一律不得销售。目前，用于三聚氰胺残留物定量检测的金标准是色谱/质谱法，但其需要复杂的样品前处理过程以及昂贵的检测费用。ELISA方法和免疫层析试纸条，所需检测时间相对短，但其检测限有限。因此，需要开发一种简单、快速、灵敏、经济的三聚氰胺检测方法。基于抗原抗体反应的酶联免疫ELISA方法和免疫层析技术，分别以辣根过氧化物酶(HRP)和胶体金作为信号标记分子，受其灵敏度等的限制，检测含量有限。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)是对DNA进行扩增的一种方法，同时可以精确灵敏的定量样品中极微量的DNA的含量。因此，基于RT-qPCR超强的扩增效应以及定量分析，以DNA作为检测的标记分子，可以带来更多的优势，如:检测限低、灵敏度高、特异性好、操作简单以及高通量分析等。`抗原抗体免疫识别原理结合DNA的扩增分析，通过DNA扩增产生的荧光信号，间接测定待检目标物的含量。本方法的最大优点在于可以实现三聚氰胺飞克级的检测水平，是目前实现三聚氰胺检测灵敏度最高的一种方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种DNA标记的免疫传感器，通过免疫识别和PT-qPCR的扩增与定量效应，通过DNA扩增产生的荧光信号对三聚氰胺进行间接检测。本专利技术的技术方案:一种测定三聚氰胺的DNA标记的免疫传感器的构建方法,包括:DNA-三聚氰胺抗体偶联物的制备，三聚氰胺包被抗原包被PCR管，三聚氰胺传感器的构建；具体步骤为:(I) DNA-三聚氰胺抗体偶联物的制备2.5mg双异功能团偶联剂4_(N_马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)溶解于200 μ L超纯水，取2 μ LSulfo-SMCC溶液用pH7.4含150mMNaCl的IOOmM PBS缓冲液稀释至200 μ L，然后取200 μ L 6mg/mL的三聚氰胺抗体与200 μ LSulfo-SMCC稀释液进行混合，使其终体积为400 μ L，于室温振荡反应30min，用截留分子量为3000的超滤管对反应物进行超滤，以除去多余的偶联剂；超滤截留物用含5mM EDTA的IOOmM PBS缓冲液溶解并恢复其原体积400 μ L，取200 μ L上述溶解溶液用于下步反应；将200 μ L 4nmol 89bp的ssDNA加入到200 μ L的溶解溶液中，室温振荡反应30min，反应复合物用截留分子量50000的超滤管超滤，以除去未结合的DNA，此步骤超滤两次，以保证DNA被完全除去；最后截留物再用400μ 含5mM EDTA的IOOmM PBS缓冲液溶解，得到偶联好的DNA-三聚氰胺抗体偶联物；所述89bp 的 ssDNA 为:5’ -SH-GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CATTAGTCCT AGACAACGTT ACTATAACGTGAATGTAATG AACCTACAAG ACCTTCCAGA TTTTTCGGC-3’ ；(2)三聚氰胺包被抗原包被PCR管首先将PCR管用50 μ L 0.8%的戊二醛溶液在37°C包被5h，然后用超纯水将PCR管洗涤三次，每次5min ;用50 μ L 8 μ g/mL的三聚氰胺包被抗原包被PCR管，在 37°C包被 2h，用 ρΗ7.2、含 0.05% Tween-20UOmM PBS 的 PBST 缓冲液洗涤，再用 ρΗ7.2、含0.4%明胶、IOmM PBS封闭缓冲液于37°C封闭2h，封闭结束后用上述PBST缓冲液洗涤干净；以上洗漆步骤均洗漆3次,每次3min ；(3)三聚氰胺传感器的构建在步骤(2)包被好的PCR管中，加入25yL 0.001pg/g 10pg/g的十倍梯度稀释的三聚氰胺标准品，再加入25 μ L步骤(I)合成的DNA-三聚氰胺抗体偶联物，在37°C反应30min后，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min，最后将PCR管拍打干净；将上游引物和下游引物加入到SsoFast EvaGreen预混液中(购自南京润亚生物科技发展有限公司，南京市玉兰路86号)，使上游引物和下游引物的最终浓度均为20nM，将预混液充分混匀，每个PCR管中加入50 μ L含上游引物和下游引物的预混液,最后用荧光定量PCR仪CFX-96进行测定。扩增条件为:首先95°C预变性30s，然后95°C变性5s、57°C退火和延伸30s，总共为39个循环；再从65°C升温至95°C，每0.5°C读取一次荧光值，得到DNA熔解曲线；上游引物:5’ -GGGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT-3，，下游引物:5’-GCCGAAAAATCTGGAAGGTC-3’。所述三聚氰胺包被抗原的合成:将半抗原MEL-ACA (氨基己酸)采用混合酸酐法偶联到载体蛋白OVA上制备包被原。将20mg半抗原MEL-ACA加入ImL N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)溶解，4°C下加入20 μ L三正丁胺和16 μ L氯甲酸异丁酯，在4°C搅拌下反应2h，得到A液；称取IOOmg OVA溶解在8mL硼酸盐缓冲溶液(0.2mol/L, pH9.0)中，为B液；在室温磁力搅拌下，将B液缓慢滴加到A液中，并在搅拌条件下继续反应3h，期间分两次共加入2mL的磷酸盐缓冲液，即得到人工抗原混合液；将人工抗原混合液移入透析袋中，用0.0lmol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液透析3-4天，每天更换2次磷酸盐缓冲液，即得到人工抗原:三聚氰胺-牛血清蛋白(此合成方法参照本申请人的专利申请:一种三聚氰胺人工抗原的合成方法，公开号为CN101402683A)。 透析结束后离心取上清，分装于0.5mL离心管中，置于_20°C保藏待用。所述三聚氰胺抗体的制备:将上述三聚氰胺-牛血清蛋白作为免疫原，与等量弗氏完全佐剂混合充分乳化后注射6-8周龄的雌性BALB/C小鼠，采取颈背部皮下多点注射，免疫剂量为100μ g/只，每间隔3周加强免疫一次，待血清效价达到要求后采用腹腔注射进行冲击免疫，冲免剂量为50 μ g/只；挑选出用于细胞融合的小鼠于融合前三天进行冲刺免疫，融合当天，无菌取出脾脏，制备脾细胞悬液并收集于50mL离心管内，将脾细胞与骨髓瘤细胞SP20按5-10: I的比例混合于50mL融合管中，按照常规方法进本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定三聚氰胺的DNA标记的免疫传感器的构建方法，其特征在于包括：DNA？三聚氰胺抗体偶联物的制备，三聚氰胺包被抗原包被PCR管，三聚氰胺免疫传感器的构建；具体步骤为：（1）DNA？三聚氰胺抗体偶联物的制备2.5mg双异功能团偶联剂4？(N？马来酰亚胺甲基)环己烷？1？羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐Sulfo？SMCC溶解于200μL超纯水，取2μL？Sulfo？SMCC溶液用pH7.4含150mM？NaCl的100mM？PBS缓冲液稀释至200μL，然后取200μL？6mg/mL的三聚氰胺抗体与200μL？Sulfo？SMCC稀释液进行混合，使其终体积为400μL，于室温振荡反应30min，用截留分子量为3000的超滤管对反应物进行超滤，以除去多余的偶联剂；超滤截留物用含5mM？EDTA的100mM？PBS缓冲液溶解并恢复其原体积400μL，取200μL上述溶解溶液用于下步反应；将200μL？4nmol？89bp的ssDNA加入到200μL的溶解溶液中，室温振荡反应30min，反应复合物用截留分子量50000的超滤管超滤，以除去未结合的DNA，此步骤超滤两次，以保证DNA被完全除去；最后截留物再用400μL含5mM？EDTA的100mM？PBS缓冲液溶解，得到偶联好的DNA？三聚氰胺抗体偶联物；所述89bp的ssDNA为：5’？SH？GGGAAAATGC？AAGAAGAAGT？CATTAGTCCT？AGACAACGTT？ACTATAACGT？GAATGTAATG？AACCTACAAG？ACCTTCCAGA？TTTTTCGGC？3’；（2）三聚氰胺包被抗原包被PCR管首先将PCR管用50μL？0.8%的戊二醛溶液在37℃包被5h，然后用超纯水将PCR管洗涤三次，每次5min；用50μL？8μg/mL的三聚氰胺包被抗原包被PCR管，在37℃包被2h，用pH7.2、含0.05%？Tween？20、10mM？PBS的PBST缓冲液洗涤，再用pH7.2、含0.4%明胶、10mM？PBS封闭缓冲液于37℃封闭2h，封闭结束后用上述PBST缓冲液洗涤干净；以上洗涤步骤均洗涤3次，每次3min；（3）三聚氰胺传感器的构建在步骤（2）包被好的PCR管中，加入25μL？0.001pg/g～10pg/g的十倍梯度稀释的三聚氰胺标准品，再加入25μL步骤（1）合成的DNA？三聚氰胺抗体偶联物，在37℃反应30min后，用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min，最后将PCR管拍打干净；将上游引物和下游引物加入到SsoFast？EvaGreen预混液中，使上游引物和下游引物的最终浓度均为20nM，将预混液充分混匀，每个PCR管中加入50μL含上游引物和下游引物的预混液，最后用荧光定量PCR仪CFX？96进行测定；扩增条件为：首先95℃预变性30s，然后95℃变性5s、57℃退火和延伸30s，总共为39个循环；再从65℃升温至95℃，每0.5℃读取一次荧光值，得到DNA熔解曲线；上游引物:？5’？GGGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT？3’，下游引物:？5’？GCCGAAAAATCTGGAAGGTC？3’。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，尹红红，徐丽广，王利兵，匡华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。