显微镜系统和用显微镜系统检测从样本发射的荧光的方法技术方案

公开了显微镜系统和用显微镜系统检测从样本发射的荧光的方法。具体公开了用于检测从用至少四种预定荧光染料标记的样本发射的荧光的方法，其中，至少四种不同的荧光染料包括形成荧光染料对的第一荧光染料和第二荧光染料，第一荧光染料和第二荧光染料具有部分重叠的激发光谱以及部分重叠的发射光谱。根据本发明专利技术，通过以下来实现对来自至少四种预定荧光染料的荧光的检测：选择针对第二荧光染料的激发波长间隔以使得对第一荧光染料的激发减少；以及选择第一荧光染料的发射波长范围以使得对来自第二荧光染料的光发射的渗漏减少。

Microscope system and method of detecting fluorescence emitted from samples by microscope system

【技术实现步骤摘要】
显微镜系统和用显微镜系统检测从样本发射的荧光的方法本申请是申请日为2014年12月11日、申请号为201480068794.3(PCT国际申请号为PCT/SE2014/051484)、专利技术名称为“用于荧光显微镜以检测来自多种荧光染料的光发射的系统和方法”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术总体上涉及荧光显微镜，更具体地，涉及改进用于显微镜系统的方法和相应的荧光显微镜系统，其用于允许分离检测来自用多种不同的荧光染料标记的样本的光发射。
技术介绍
荧光显微镜是用于通过对来自位于样本上或位于样本中的目标物质(诸如有机分子或无机化合物)的荧光或磷光发射进行成像来研究样本的结构或性质的光学显微镜技术。例如，可以用一种或多种不同的荧光染料(也被称为荧光团)来标记样本，当分子吸收光时通过各种方式随后处置其增大的能量，这些方式之一是发射具有更长波长的光。当用紫外光、可见光、远红光、近红外光或红外光照射这样的分子时，这样的分子会经历分子吸收一定量的能量的电子跃迁，并且电子从其在基态下占据的轨道被激发至另一较高能量的轨道。被照射的分子吸收光的波长光谱被称为吸收光谱或激发光谱。大多数激发状态是短暂的，并且所吸收的能量的主要去向是重新发射如磷光或荧光那样的光。被照射的分子发射光的波长光谱被称为发射光谱。有机染料和无机染料的荧光特性为许多分析方法提供了基础，这些分析方法之一是荧光免疫检验法(immunofluorescence)，其使用荧光染料缀合的抗体来检测蛋白质和其他分子。通常用于这样的分析的示例性荧光显微镜包括：光源；用于将光传送至激发光路中的光学器件；激发滤光器，用于选择要被传送至对象的一种或多种激发波长带；分色镜(dichroicmirror)，被配置成将激发波长带反射至样本、同时将来自样本的荧光发射波长透射至发射光路；发射滤光器，用于阻挡被透射至发射光路中的任何杂散激发光波长；以及用于将荧光发射波长传送至眼部或者传送至诸如摄像装置的图像捕获装置的光学器件。通常，所有的现代显微镜都设置有多种可快速切换的“滤光块(filtercube)”，每个滤光块专用于特定荧光染料(或一组相似的荧光染料)并且包括一组匹配的激发滤光器、分色镜以及发射滤光器。可以通过连续地、一次一个地通过匹配的滤光器组进行切换来容易地实现对不同荧光染料的分离且连续的可视化。对均具有分离的激发/发射波长光谱的不同荧光染料的这样依次的可视化可以例如用于通过使用荧光蛋白(例如，GFP)或荧光染料标记的抗体(所谓的荧光免疫检验法)来展现在组织内的两种(或更多种)蛋白质的空间位置，或者通过使用荧光染料标记的核酸(探针)来检测细胞中的两种(或更多种)DNA突变。在这样的研究中，通常存在组合许多通道以获得信息的期望。例如，在生物学研究中，通常通过使用标记有不同荧光染料的细胞特有的抗体来使组织样本内的若干不同的细胞类型可视化。然而，因为从不同的荧光染料渗漏的光发射，因此当今在同一样本内允许明显地分离仅有限数量的荧光团。可以通过补偿(即，对来自部分交叠的荧光染料光谱的信号的添加进行补偿的基于计算机的计算)来解决渗漏的问题(还被称为溢出伪影(spill-overartifact))。然而，这在研究或实验室医学中是不常规使用的复杂处理。因此，会期望提供一种被配置用于对来自多于四种不同的荧光染料的光发射进行简化分离并且对来自多于四种不同的荧光染料的光发射进行改进的检测的方法和显微镜系统。
技术实现思路
根据本专利技术的第一方面，以上问题是通过用于使用包括光源装置的显微镜系统来检测从用多种预定荧光染料标记的样本发射的荧光的方法来至少部分地减轻的，其中，该方法包括以下步骤：选择被配置成发射在可见光谱内的光的至少四种不同的荧光染料，至少四种不同的荧光染料包括形成荧光染料对的第一荧光染料和第二荧光染料；选择针对至少四种不同的荧光染料的激发波长间隔，其中，选择针对第二荧光染料的激发波长间隔以使得对第一荧光染料的激发减少；将显微镜系统的滤光器装置配置成选择性地允许在与至少四种不同的荧光染料的发射波长间隔匹配的发射波长间隔内的光通过，其中，选择针对第一荧光染料的发射波长间隔以减少从第二荧光染料渗漏的光发射；顺序地发射在所选择的激发波长间隔的至少一部分内的光；以及检测从样本发射的透过滤光器装置的光，其中，荧光染料对被选择为形成第一荧光染料的Cy3类荧光染料和形成第二荧光染料的594类荧光染料，或者荧光染料对被选择为形成第一荧光染料的425类荧光染料和形成第二荧光染料的488类荧光染料。还可以通过使用具有不同斯托克位移的两种荧光染料来形成荧光染料对。斯托克位移是激发波长间隔与发射波长间隔之间的位移。以这种方式，两种荧光染料可以利用相同的激发波长间隔来激活，并且通过两种不同的发射滤光器来分离，这两种不同的发射滤光器被配置成使得选择针对第一荧光染料的发射波长间隔以减少从第二荧光染料渗漏的光发射，以及选择针对第二荧光染料的发射波长间隔以减少从第一荧光染料渗漏的光发射。由于一个发光二极管(下文进一步讨论的LED)可以用于激活两种荧光染料，因此这会例如当使用LED来替代激发滤光器来激活荧光染料时是有益的。在优选实施例中，可以在荧光染料对之上添加斯托克位移大的荧光染料，从而形成荧光染料三联体(triplet)。这可以例如利用与425/488对组合的PerCP来实现。本专利技术基于以下理解：通过解决分离从用第一荧光染料和第二荧光染料标记的样本发射的荧光信号的主要问题，优点将如下，即减小了还使得能够分离出自第三荧光染料和第四(不同的)荧光染料的另外的荧光信号的复杂度，这限于以下情况：荧光染料发射在可见光谱内(例如，通常在400nm至640nm的范围内)的光并且第一荧光染料和第二荧光染料分别是为Cy3类荧光染料和594类荧光染料的荧光染料组合/对，或者第一荧光染料和第二荧光染料分别是为425类荧光染料和488类荧光染料的荧光染料组合/对。根据本专利技术，这是通过以下获得的：选择针对第二荧光染料的激发波长间隔以使得对第一荧光染料的激发减少；以及选择针对第一荧光染料的发射波长间隔以使得从第二荧光染料渗漏的光发射减少。在本专利技术的范围内，可以允许对至少四种荧光染料的信号分离。然而，每个样本不必一定在任何给定时间处用至少四种荧光染料来标记。因此，借助于本专利技术使可以分离的至少四种荧光染料可用，但是这至少四种荧光染料不一定“同时”全部顺序地被激发，例如，在一些实施例中，可以激发至少四种荧光染料中的仅一种、两种或三种荧光染料，但是显微镜具有分离来自至少四种荧光染料中的任何荧光染料的信号的能力。关于以上所讨论的荧光染料对之一，术语“Cy3类荧光染料”和“594类荧光染料”应当在其最广泛的意义上被解释(参见图6，例如关于具有类似激发光谱和发射光谱的荧光染料)，包括具有类似的激发/发射光谱的任何有机或无机化合物。应当注意，列表是非排他性的，并且目前和将来的另外的等同荧光染料可以被预期并且在本专利技术的范围内。关于以上所讨论的荧光染料对中的另一个，术语“425类荧光染料”和“488类荧光染料”本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种方法，用于使用包括控制单元和光源装置的显微镜系统来检测从用多种预定的荧光染料标记的样本发射的荧光，所述控制单元被配置成控制所述光源装置的操作，所述光源装置被配置成包括发射在可见光谱内的光的多个发光二极管，其中，所述方法包括以下步骤：/n-选择至少四种不同的荧光染料，所述至少四种不同的荧光染料被配置成发射在可见光光谱内的光，所述至少四种不同的荧光染料包括形成荧光染料对的第一荧光染料和第二荧光染料，所述第一荧光染料和所述第二荧光染料具有部分重叠的激发光谱以及部分重叠的发射光谱；/n-选择针对所述至少四种不同的荧光染料的激发波长间隔，其中，选择针对所述第二荧光染料的激发波长间隔以使得所述第一荧光染料的激发减少；/n-将所述显微镜系统的滤光器装置配置成选择性地允许在与所述至少四种不同的荧光染料的发射波长间隔匹配的发射波长间隔内的光通过，其中，选择针对所述第一荧光染料的发射波长间隔以不激发所述第二荧光染料；/n-使用所述控制单元来顺序地激活所述多个发光二极管中的每一个以发射在所选择的激发波长间隔的至少一部分内的光；以及/n-检测从所述样本发射的透过所述滤光器装置的光，/n其中，/n-所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的Cy3类荧光染料和形成所述第二荧光染料的594类荧光染料，或者所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的425类荧光染料和形成所述第二荧光染料的488类荧光染料，/n-针对所述Cy3类荧光染料的激发波长间隔为535-555nm，/n-针对所述Cy3类荧光染料的发射波长间隔为555-590nm，/n-针对所述594类荧光染料的激发波长间隔为585-615nm，以及/n-针对所述594类荧光染料的发射波长间隔为605-655nm。/n...

【技术特征摘要】
20131216 SE 1351503-61.一种方法，用于使用包括控制单元和光源装置的显微镜系统来检测从用多种预定的荧光染料标记的样本发射的荧光，所述控制单元被配置成控制所述光源装置的操作，所述光源装置被配置成包括发射在可见光谱内的光的多个发光二极管，其中，所述方法包括以下步骤：
-选择至少四种不同的荧光染料，所述至少四种不同的荧光染料被配置成发射在可见光光谱内的光，所述至少四种不同的荧光染料包括形成荧光染料对的第一荧光染料和第二荧光染料，所述第一荧光染料和所述第二荧光染料具有部分重叠的激发光谱以及部分重叠的发射光谱；
-选择针对所述至少四种不同的荧光染料的激发波长间隔，其中，选择针对所述第二荧光染料的激发波长间隔以使得所述第一荧光染料的激发减少；
-将所述显微镜系统的滤光器装置配置成选择性地允许在与所述至少四种不同的荧光染料的发射波长间隔匹配的发射波长间隔内的光通过，其中，选择针对所述第一荧光染料的发射波长间隔以不激发所述第二荧光染料；
-使用所述控制单元来顺序地激活所述多个发光二极管中的每一个以发射在所选择的激发波长间隔的至少一部分内的光；以及
-检测从所述样本发射的透过所述滤光器装置的光，
其中，
-所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的Cy3类荧光染料和形成所述第二荧光染料的594类荧光染料，或者所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的425类荧光染料和形成所述第二荧光染料的488类荧光染料，
-针对所述Cy3类荧光染料的激发波长间隔为535-555nm，
-针对所述Cy3类荧光染料的发射波长间隔为555-590nm，
-针对所述594类荧光染料的激发波长间隔为585-615nm，以及
-针对所述594类荧光染料的发射波长间隔为605-655nm。


2.根据权利要求1所述的方法，还包括如下步骤：分离来自所述至少四种不同的荧光染料的荧光信号。


3.根据权利要求1所述的方法，还包括选择至少五种不同的荧光染料，其中，针对所述至少五种不同的荧光染料选择激发波长间隔并且针对所述至少五种不同的荧光染料配置所述滤光器装置，所述荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的所述Cy3类荧光染料和形成所述第二荧光染料的所述594类荧光染料，以及另外的荧光染料对被选择为形成所述第一荧光染料的所述425类荧光染料和形成所述第二荧光染料的所述488类荧光染料。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括：选择至少一种另外的荧光染料，所述至少一种另外的荧光染料被配置成发射在远红光/近红外光谱内的光。


5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括：选择至少一种另外的荧光染料，所述至少一种另外的荧光染料被配置成发射在红外光谱内的光。


6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：佩尔·福格尔斯特兰德，
申请(专利权)人：克罗姆尼贡公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE