DOCK2基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用制造技术

本发明专利技术属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及DOCK2基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用。所述的分子标记由猪DOCK2基因克隆得到，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在该序列的第35位碱基处有一个A35-G35的碱基突变，通过在正向引物倒数第四位碱基位置引入突变，使得A35-G35形成BstZ17I-RFLP多态。本发明专利技术为猪免疫性状的标记辅助选择提供了一个新的SNP分子标记。

【技术实现步骤摘要】
DOCK2基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用
本发现属于家畜分子标记制备
，具体涉及DOCK2基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用。
技术介绍
我国养猪历史悠久，养猪经验和品种资源极为丰富，养猪数量稳居世界榜首，并推动了世界养猪业的发展。然而，养猪业的发展也面临着很多挑战，其中突出的问题是对某些疫病的控制能力尚低，在疾病监测、诊断、预防和扑灭等环节仍存在很多问题，因此，在养殖生产过程中的疾病问题是影响养猪业发展的关键性问题之一。生猪养殖过程中疾病的爆发可直接导致生猪的死亡，出栏率降低，进而影响生猪养殖的经济效益。于此同时，为了预防疾病而大量使用药物一方面增加养殖成本，另一方面也导致了病菌耐药性出现而使得养殖场疾病的防治更加艰难，药物大量使用也使得猪肉食品安全问题突出。因此，在生猪养殖过程中的疾病防控，直接关系到这一产业的发展和猪肉食品市场。尽量避免大量使用药物，寻找抗病新策略，从培育抗病品系入手，是改善养猪行业行情的热门研究方向。外来种猪在育成的过程中生长性状受到强烈选择，有研究表明生长与免疫存在负相关(唐国庆等,猪抗病育种研究进展.中国畜牧兽医,2002,29(6):29-32；严燕等,猪遗传抗性与抗病育种研究进展.猪业科学,2007,6:58-61.)，中外猪种在抗病、抗逆性状中存在明显差异(唐利洲等,MHC基因对地方保护猪种抗病选育的应用前景.畜牧与饲料科学,2010,31(2):142-143；施启顺等,不同猪种E.coliF18受体基因的多态性.遗传学报,2003,30(3):221-224.)。本申请人利用全基因组信息进行进化分析，发现DOCK2(DedicatorofCytokinesis2)基因在中外猪种中基因频率存在显著差异，这表明该基因受到了强烈选择。功能分析发现，DOCK2基因的第3内含子区在物种间高度保守，其中一个高度保守的CEBPβ转录因子结合位点存在一个A/G多态，在中国地方猪品种中G等位基因频率很高，外来猪品种中A等位基因频率很高。大量的研究表明DOCK2基因在机体免疫抗病中发挥重要作用。DOCK2属于造血细胞特异表达的CDM蛋白家族成员(Nishihara,T等,Non-adherentcell-specificexpressionofDOCK2,amemberofthehumanCDM-familyproteins.Biochem,1999,1452:179-187.)；研究表明CDM蛋白家族在细胞表面延伸过程起重要作用(Y.C.Wu等,C.elegansphagocytosisandcell-migrationproteinCED-5issimilartohumanDOCK180.Nature,1998,392:501-504.)。功能研究表明DOCK2主要通过激活Rac促进免疫细胞伪足形成，促进免疫细胞迁移，而免疫细胞迁移在机体免疫作用中发挥重要功能(Lauffenburger,D.A等,Cellmigration:aphysicallyintegratedmolecularprocess.Cell,1996,84:359-369；YoshinoriFukui等,Haematopoieticcell-specificCDMfamilyproteinDOCK2isessentialforlymphocytemigration.Nature,2001,412:826-831.)。Rac属于Rho家族，具有GTP酶活性，Rac激活会引起免疫细胞表面肌动蛋白纤维丝的组装，从而导致免疫细胞表面形成伪足和褶皱，促使免疫细胞往高浓度趋化因子部位迁移(AlanHall,RhoGTPasesandtheactincytoskeleton.Science,1998,279:1995；HiroshiNishihara等,DOCK2associateswithCrkLandregulatesRac1inhumanleukemiacelllines.Blood,2002,100:3968-3974.)。另外，DOCK2还能够通过调节肌动蛋白细胞骨架，影响淋巴细胞归巢和免疫突触形成；DOCK2缺陷的受体因在器官移植中MHC抗原递呈存在障碍，从而降低免疫排斥反应(HongsiJiang等,DeletionofDOCK2,aregulatoroftheactincytoskeletoninlymphocytes,suppressescardiacallograftrejection..JEM,2005,202:1121-1130.)。DOCK2基因突变会抑制体内Rac1活化，从而减低T细胞、B细胞和NK细胞在趋化因子诱导时的迁移能力；而当侵入性病毒感染DOCK2基因突变的外周血单核细胞时，IFN-α和IFN-λ分泌显著减少。在DOCK2缺陷的成纤维细胞中，病毒复制增加，被病毒感染的细胞的死亡的发生也增加(KerryDobbs,B.S.等,InheritedDOCK2deficiencyinpatientswithearly-onsetinvasiveinfections.TheNewEnglandJournalofMedicine,2015,372:2409-2422.)。这些研究都表明DOCK2在机体免疫抗病中发挥重要作用。本专利技术申请中，申请人克隆了DOCK2基因的第3内含子片段，鉴定了一个与猪免疫性状密切相关的功能突变位点，为猪免疫性状的的标记辅助选择提供了新的SNP分子标记。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过PCR扩增DOCK2基因第3内含子片段，利用CRS-PCR-RFLP技术，在杜洛克×二花脸F2代群体中进行分型，分型结果与该群体的免疫指标关联分析，进而鉴定与猪免疫性状相关的分子标记，为猪的抗病育种提供了新的分子标记。申请人通过基因克隆的方法，得到DOCK2基因第3内含子序列，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所述。在该序列的35bp处存在一个A35-G35等位基因的碱基突变，通过在正向引物倒数第四位碱基位置引入突变，使得A35-G35形成BstZ17I-RFLP多态。申请人将该基因片段作为检测猪免疫性状的分子标记。为了扩增DOCK2基因第3内含子序列，申请人设计了如下所示的引入酶切位点的引物对：正向引物：5’-AGATAAGCCACCACGGAATGGAGAAATTGCgTAT-3’(见序列表SEQIDNO：2)反向引物：5’-ATCCCTGGTCTGTGGCATGTCC-3’(见序列表SEQIDNO：3)。同时申请人制备了检测上述与猪免疫性状相关的分子标记的引物对，该引物对的DNA序列如下所示：正向引物：5’-AGATAAGCCACCACGGAATGGAGAAATTGCgTAT-3’(见序列表SEQIDNO：2)反向引物：5’‐ATCCCTGGTCTGTGGCATGTCC‐3’(见序列表SEQIDNO：2)。申请人提供了一种猪免疫性状的分子标记的制备方法，其包括下列步骤：1)提取猪耳样组织基因组DNA；2)对DOCK2基因第3内含子片段进行扩增、纯化与测序；3)利用CRS‐PCR‐RFLP方法对该片段在突变位点进行分型；4)利用SAS9.1软件进行基因型本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪免疫性状的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述，在所述的序列的35bp处有一个A35‑G35的碱基突变，导致BstZ17I‑RFLP多态性。

【技术特征摘要】
1.一种猪免疫性状分子标记在猪免疫性状标记辅助选择中的应用，其特征在于，它的核苷酸序列如SEQIDNO：1所述，在所述的序列的35bp处有一个A35‐G35的碱基突变，导致BstZ17I‐RFLP多态性。2.一种猪免疫性状...

【专利技术属性】
技术研发人员：李新云，倪娟，李世军，赵书红，曹建华，刘向东，谢胜松，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42