全血的标记免疫分析方法和即时检测系统技术方案

本发明专利技术具体涉及从全血中通过特异性结合反应快速采集目标物并通过标记技术对目标物进行标记和监测的全血的标记免疫分析方法，以及一种即时检测系统。所述方法包括以下步骤：1）磁珠捕获；2）血液洗脱；3）检测抗体的标记；4）检测抗体的洗脱；和5）检测。所述系统包括微流控芯片、设置在微流控芯片上下一方或两方的磁场产生装置以及检测装置，所述微流控芯片包括微通道、设置在微通道内的磁珠、废液出口和洗脱液贮液池，所述微通道通过隔断机构阶段性隔离为第一反应区域、第二反应区域和检测区。本发明专利技术提供的技术方案具有灵敏度高、重复性好、系统结构简单、成本低等特点，可以快速的从微量血液样本中定量检测出目标物。

【技术实现步骤摘要】
全血的标记免疫分析方法和即时检测系统
本专利技术属于快速标记免疫分析技术，具体涉及从全血中通过特异性结合反应快速采集目标物并通过标记技术对目标物进行标记和监测的方法，以及ー种即时检测系统。
技术介绍
标记免疫技术具有选择性高、灵敏度高、普适性好等优点，主要包括放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、化学发光免疫技木，采用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体(或抗原)进行抗原-抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的測定，达到对免疫反应进行监测的目的。即时检测(Point-of-care testing, P0CT)是指在采样现场即刻进行分析,省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的ー类方法。POCT中免疫分析方法目前已广泛用于医疗卫生、环境监测、反恐等领域的快速检测，POCT检测常用的对象是全血样本，并且样品量极少，其较常用的方法是通过毛细管作用驱动血液透过多孔膜实现血细胞与血浆的分离，分离得到的血浆进一歩在毛细管作用下进入反应装置，完成免疫检测。按照惯例，血浆可以通过离心法从全血中分离出来，但离心法很耗时，需要特种设备，不适合用于即时测试中。为了避免这个问题，一般采用具有微孔滤质的机械式过滤器分离血浆和红细胞，文献CNl01918137A中公开了ー种类似的采用过滤材料的分离装置，但由于微孔阻塞的问题，该分离方法会造成检测样品的损失，因此对于只有极少量样品的POCT并不适用。POCT装置由于受到小体积、低成本和使用便捷等要求的限制，在极少的样品量的情况下，无法准确控制检测过程和剔除背景干扰，检测的可靠性与精度大大降低。例如，在用吸收膜做为样品和反应试剂载体的方法中难以准确控制控制反应试剂进入检测装置的流速以及在各个特定反应腔中停留的时间，并且常缺乏充分的洗脱以消除非特异性吸附造成的背景干扰。在基于微流控芯片的检测中，为了充分洗脱、准确控制样品及反应试剂的流速和反应时间常需要复杂的阀控结构，増加了装置的体积、成本和复杂度，同时降低了检测系统的可靠性。因此只有中心实验室的大型仪器才具有高灵敏度、高重复性以及准确定量的能力，可以获得准确的实验数据，但其与快速检测方法相比，设备体积大，成本高，检测时间长。超顺磁性纳米微球(superparamagneticsnano spheres/particles/beads)简称磁珠，是由Senyei A E在1978年首先研制出来的ー种新型的功能性材料。它的内部是ー个磁核，因而在外部磁场的作用下，微球可以定向移动；而微球外部是ー层包覆层，表面分布着许多活性基团，可以和细胞、蛋白质、核酸、酶等生化试剂发生偶联。用于生化分析的磁珠具有以下特点:1)超强的顺磁性，就是指在磁场的存在下能迅速聚集，离开磁场能够均匀分散，不出现聚集显现现象，文献CN102333595A中即公开一种使多个顺磁颗粒在小体积液体中团聚井随后均匀分布的方法；2)合适的粒径且粒径分布范围窄，使微球有足够强的磁响应性，又不会因粒径太大而发生沉降；3)具有丰富的表面活性基团，以便微球可以和生化物质偶联，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是目前的即时检索方法灵敏度、稳定性和可重复性低，为了克服以上不足，提供了一种全血的快速免疫分析方法和即时检测系统。为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是:所述全血的快速标记免疫分析方法，包括以下步骤:I)磁珠捕获:抗凝剂处理的全血样本与负载捕获抗体的磁珠在第一反应区域混合，所述捕获抗体与全血样本中待测抗原结合形成ー抗免疫复合物；2)血液洗脱:施加磁场将ー抗免疫复合物聚集、洗脱液替换掉流体；3)检测抗体的标记:施加磁场将磁珠转移至第二反应区域，采用标记免疫技术，检测抗体与ー抗免疫复合物的待测抗原反应形成ニ抗免疫复合物；4)检测抗体的洗脱:施加磁场将ニ抗免疫复合物聚集，加入洗脱液将未结合的检测抗体洗脱；和5)检测:施加磁场将步骤4)清洗后的ニ抗免疫复合物移入检测区并进行检测。本专利技术的分析方法中摒弃了血液的机械式过滤器分离方法，比如通过多孔过滤膜。虽然多孔过滤膜与离心分离技术相比更适合POCT的需求，但分离后的血浆一般不到初始血液体积的15%，大类目标物损失在分离过程中，因而降低了检测系统的灵敏度，并且多孔过滤膜的使用増加了系统的复杂度，降低了检测的可重复性。而本专利技术直接将负载捕获抗体的磁珠与抗凝血液混合，捕获抗体与血液中目标物相结合，然后通过磁场将其聚集固定，通过洗脱液将其从血液中分离出来，減少了分离过程中的目标物损失，大大提高了检测灵敏度。优选地是，在步骤I)和/或步骤3)中，通过磁力变化使磁珠快速运动，促进捕获抗体与待测抗原之间和/或检测抗体与待测抗原之间的结合。通过磁力的变化，比如磁极的变化、磁场的施加与撤销等，从而磁珠在体系内快速运动。优选地是，所述标记免疫技术选自酶免疫标记技术(ELISA)或化学发光免疫技术(CLIA)0所述酶免疫标记技术或化学发光免疫技术均可用于定量測定。所述酶免疫标记技术是指酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量測定。所述化学发光免疫技术是利用化学或生物发光系统作为抗原抗体反应的指示系统，借以定量检测抗原或抗体的方法，发光物质可直接作为抗原抗体的标记物，也可以游离形式用于催化剂(酶)和辅助剂标记的抗原或抗体的发光反应中。优选地是，所述全血样本的体积为2?20微升。由于采用了新的全血分离方法，使得全血样本的体积大大減少，非常有利于小型化的POCT检测。本专利技术还提供了ー种即时检测系统，包括微流控芯片、设置在微流控芯片上下一方或两方的磁场产生装置以及检测装置，所述微流控芯片包括微通道、设置在微通道内的负载捕获抗体的磁珠、设置在微通道一端的废液出口和设置在微通道另一端的洗脱液贮液池，所述微通道通过隔断机构阶段性隔离为第一反应区域、第二反应区域和检测区，所述第一反应区域设置血液进样ロ，所述第二反应区域与标记所需物质相关的贮液池相连，所述检测装置对检测区内物质进行检测。本专利技术提供的检测系统不再依赖毛细管作用力驱动样本的流动。依赖毛细管驱动需对微通道进行表面处理，而这种表面处理往往难以准确控制样品流速及在各个特定位置的停留时间，并且这种表面改性难以长久保持，因而造成检测的可重复性和稳定性低。本专利技术通过磁场的控制来准确引导样本的移动和定位，通过隔断机构保证样本在特定位置的停留时间，避免了交叉干扰，系统简单且控制简便，系统稳定性和重复性好。优选地是，所述隔断机构为阀或插片。隔断方法简单易行，效果显著。优选地是，所述废液出口设置在微通道上第一反应区域所处一端，所述洗脱液贮液池设置在微通道上检测区所处一端。优选地是，所述微通道内第一反应区域与第二反应区域之间还设置有物理斜坡，所述物理斜坡的垂直障碍高度为0.l-2mm。所述物理斜坡防止剰余的滞留物从第一反应区域的下部部分流入第二反应区域，只有通过磁场转移的磁珠可以顺利从第一反应区域进入第二反应区域，进ー步降低了系统的背景噪音。优选地是，所述第一反应区域部分的所述第一反应区域部分的体积为2-40微升。优选地是，所述磁场产生装置的磁场由永磁铁或电磁铁提供。需要指出的是，虽然全血检测采用专利技术的技术方案的技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全血的快速标记免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：1）磁珠捕获：抗凝剂处理的全血样本与负载捕获抗体的磁珠在第一反应区域混合，所述捕获抗体与全血样本中待测抗原结合形成一抗免疫复合物；2）血液洗脱：施加磁场将一抗免疫复合物聚集、洗脱液替换掉流体；3）检测抗体的标记：施加磁场将磁珠转移至第二反应区域，采用标记免疫技术，检测抗体与一抗免疫复合物的待测抗原反应形成二抗免疫复合物；4）检测抗体的洗脱：施加磁场将二抗免疫复合物聚集，加入洗脱液将未结合的检测抗体洗脱；和5）检测：施加磁场将步骤4）清洗后的二抗免疫复合物移入检测区并进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种全血的快速标记免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)磁珠捕获:抗凝剂处理的全血样本与负载捕获抗体的磁珠在第一反应区域混合，所述捕获抗体与全血样本中待测抗原结合形成ー抗免疫复合物； 2)血液洗脱:施加磁场将ー抗免疫复合物聚集、洗脱液替换掉流体； 3)检测抗体的标记:施加磁场将磁珠转移至第二反应区域，采用标记免疫技木，检测抗体与ー抗免疫复合物的待测抗原反应形成ニ抗免疫复合物； 4)检测抗体的洗脱:施加磁场将ニ抗免疫复合物聚集，加入洗脱液将未结合的检测抗体洗脱；和 5)检测:施加磁场将步骤4)清洗后的ニ抗免疫复合物移入检测区并进行检测。2.根据权利要求1所述ー种全血的快速标记免疫分析方法，其特征在于，在步骤I)和/或步骤3)中，通过磁力变化使磁珠快速运动，促进捕获抗体与待测抗原之间和/或检测抗体与待测抗原之间的结合。3.根据权利要求1或2所述ー种全血的快速标记免疫分析方法，其特征在于，所述标记免疫技术选自酶免疫标记技术(ELISA)或化学发光免疫技术(CLIA)。4.根据权利要求1-3任一所述ー种全血的快速标记免疫分析方法，其特征在于，所述全血样本的体积为2?20微升。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：施奇惠，司珂，
申请(专利权)人：司珂，施奇惠，
类型：发明
国别省市：