本发明专利技术涉及了一种大豆疫霉菌(Phytophthora?sojae)无毒基因Avr5的特异分子标记CAPS-80316和CAPS-80295，属于生物技术领域。通过利用CAPS(Cleaved?Amplified?Polymorphic?Sequence)分子标记技术，对大豆疫霉病菌两个亲本菌株(P6497，P7064)及其94个杂交后代群体进行无毒基因分子标记的筛选和鉴定；获得2个与大豆疫霉无毒基因Avr5共分离的分子标记。本发明专利技术不仅可以研究无毒基因Avr5在自然群体中的分布情况，揭示大豆疫霉菌在田间致病型分化变异的特点，而且可以为克隆该无毒基因、并最终鉴定大豆抗疫霉菌基因Rps5提供便利。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及大豆疫霉无毒基因的标记，具体涉及与大豆疫霉无毒基因Avr5紧密联锁的两个分子标记基因CAPS-80316和CAPS-80295，以及在无毒基因标记过程中所用的标记方法。
技术介绍
大豆疫霉菌属于鞭毛生物界卵菌门霜霉亚纲、腐霉目、腐霉科、疫霉属(Tyler， 2007).疫霉属包含有80多个疫霉种，很多种都是农业生产上重要的病原菌。与多数疫霉种不同，大豆疫霉菌的寄主范围非常窄，主要侵染大豆，此外仅能侵染羽扇豆属(Lupinus spp.)的几种植物。大豆疫霉菌侵染大豆，引起幼苗的猝死和成株的根腐，是世界范围内大豆生产的主要威胁之一。每年给世界范围内的大豆生产造成直接经济损失高达十几亿美元(Tyler，2007)。该病于1948年首次在美国的印地安那州发现，而后相继在澳大利亚、加拿大、巴西、阿根廷、日本、意大利、新加坡、俄罗斯、白俄罗斯、乌克兰、哈萨克斯坦、匈牙利、德国、英国、法国、瑞士、新西兰、埃及、尼日利亚、印度等国家都发现了该病害 (Schmitthenner, 1985 ；Wrather et al.，2001)。我国 1989 年由沈崇尧和苏彦纯(1991)首次在东北大豆主产区分离到该病原菌，之后在黑龙江、吉林、北京、山东、安徽、河南、江苏、 浙江、内蒙古、湖北、福建、新疆、四川、天津和贵州(苏彦纯等，1993 ；朱振东等，2003 ；徐静静等，2009;唐庆华等，2009)等15个省(市区)也相继被报道分离鉴定到大豆疫霉菌。其中在黑龙江和福建两省发生较为严重，其他省份零星发生，目前仍是我国重要的对外检疫对象。在植物与卵菌的长期协同进化过程中，卵菌为了成功侵染植物，分泌大量效应分子(effectors)到植物细胞的不同部位来破坏或延缓植物的防卫反应(Birch et al., 2006 ；Kamoun,2006 ；Vleeshouwers et al. ,2008) 大量研究表明大部分卵菌病害的发生符合Flor的“基因对基因”假说，因此，与很多植物病原细菌和真菌一样，卵菌中也存在一类效应分子可以被寄主植物的抗病基因产物(R protein)识别，从而引发强烈的植物免疫反应进而阻止病害的发生，而编码这类效应分子的基因被称为无毒基因(Avr gene) 0卵菌分泌的Avr protein与寄主植物的R protein之间的相互作用直接决定着卵菌病害的发生，因此，围绕Avr基因的研究一直是卵菌病害研究的重点之一。以前，卵菌Avr基因的研究主要集中在Avr基因的鉴定以及分子标记上，最近，由于疫霉菌基因组序列的公布以及基因枪等新技术的广泛使用，十多个卵菌Avr基因陆续被克隆。目前，已经克隆到的卵菌 Avr 基因包括来自来 Hyaloperonospora arabidopsis 的 ATRlNdWsB 禾日 ATR13 ；自 P. infestans 的 PiAvr3a、PiAvr4、PiAvrblbl 禾口 PiAvrblb2，以及来自 P. sojae 的 PsAvrlb, PsAvrla, PsAvr3a、PsAvr3c禾口PsAvr4/6(Allen et al. ,2004 ；Shan et al. ,2004 ；Armstrong etal., 2005 ；Rehmany et al. ,2005 ；van Poppel et al. ,2008 ；Vleeshouwers et al. ,2008 ；Dong etal.，2009 ；Qutob et al.，2009 ；Sang-Keun et al.，2009 ；Dou et al.，2010)。此外这些 Avr基因在基因和基因组结构上的特征、进入植物细胞的转运机理以及在植物病害中具有的毒性功能研究也成为研究热点。从卵菌无毒基因的克隆入手，探索无毒基因的起源和进化，明确其在病菌致病过程中的功能，了解无毒基因和抗病基因之间的协同进化机理，对于近一步认识和防治该类病害具有重要意义。前人发现大豆疫霉菌无毒基因Avr5和Avrfa位于同一个连锁群上，两者之间的遗传距离为4. 5cM(May et al，2002)。Avr3a最近已经被克隆，该基因编码一个长度为112氨基酸的外泌蛋白，这为进一步寻找无毒基因Avr5提供了线索。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种简便、快速鉴定大豆疫霉无毒基因Avr5 的分子标记、方法及其引物，筛选获得与无毒基因Avr5紧密连锁的分子标记。本专利技术提供的技术方案是一种检测大豆疫霉菌株中无毒基因Avr5的分子标记引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。—种大豆疫霉菌株中无毒基因Avr5的分子标记方法，利用上述的引物扩增待测大豆疫霉菌基因组DNA，对扩增产物用ScaI酶进行酶切，如果仅获得475bp的片段，表明待测大豆疫霉菌基因组含Avr5的纯合体；若获得157bp和318bp的两种片段，表明待测大豆疫霉菌基因组不含有Avr5 ；若获得157bp、318bp和475bp三种片段，表明待测大豆疫霉菌基因组是含有Avr5的杂合子。本专利技术提供另一种检测大豆疫霉菌株中无毒基因Avr5的分子标记引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。本专利技术提供另一种大豆疫霉菌株中无毒基因Avr5的分子标记方法，利用上述的引物扩增待测大豆疫霉菌基因组DNA，对扩增产物用EcoRI酶进行酶切，如果仅获得373bp 的片段，表明待测大豆疫霉菌基因组含Avr5的纯合体；若获得150bp和217bp的两种片段， 表明待测大豆疫霉菌基因组不含有Avr5 ；若获得150bp、217bp和373bp三种片段，表明待测大豆疫霉菌基因组是含有Avr5的杂合子。利用已经完成测序并公布的大豆疫霉菌基因组数据库(http://Renome. iRi-psf. org/annotator/servlet/jgi. annotation. Annotation ？ pDb = Physol_l)，确定己知无毒基因Avr3a在基因组数据库中的序列位置为Scaffold_80 300039-300374, Avr5和Avr3a 之间的遗传距离为4. 5cM。利用大豆疫霉菌基因组数据库的查询和下载功能，下载SCafTold_80 280000-320000的40kb基因组区域内的核苷酸序列，通过其网站找到基因间隔区 (Intergenic Region)，并针对这些区域设计扩增长度为IOOObp的引物并进行PCR扩增，通过PCR扩增从两个亲本菌株的基因组DNA分别纯化回收产物，送公司测序。通过测序回来的结果，利用Lasergene中的Seqman程序寻找序列的替代突变，或者插入/缺失突变位点，再通过SeqBuilder软件寻找差异的酶切位点，然后对先前对应的 PCR产物进行酶切，电泳确定差异片段从而获得优质CAPS分子标记。同时利用分别含有Avr5和不含有Avr5基因的大豆疫霉菌株杂交产生Fl代杂合子，再自交产生94个F2代，将这些F2代菌株接种到L85-3059 (含Rps5抗病基因)的大豆上，确定这些菌株的毒性本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测大豆疫霉菌株中无毒基因Ａｖｒ５的分子标记引物，其特征在于：上游引物核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示，下游引物核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：董莎萌，王源超，张正光，郑小波，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84
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