一种用于检测棕榈疫霉菌的引物对及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种用于检测棕榈疫霉菌（Phytophthora palmivora）的PCR引物对，其中上游引物PPF的核苷酸序列为：5'‑ GCAAAAGTGTTGATGGTT‑ TGG ‑3'，下游引物PPR的核苷酸序列为：5'‑ CTTGACTAGGAACGCCTGGA ‑3'。本发明专利技术同时还提供一种利用上述引物对检测棕榈疫霉菌的方法，具体包括以下步骤：（1）提取目标物DNA；（2）PCR扩增反应；（3）电泳检测。本发明专利技术提供的引物对和方法检测棕榈疫霉菌具重复性好、灵敏度高，可准确、快速地检测样品中是否存在棕榈疫霉菌，目标物DNA只需要100 pg/µL就可以检测出棕榈疫霉菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于检测棕榈疫霉菌的引物对及其检测方法，属于作物病害检测、鉴定及防治

技术介绍
棕榈疫霉菌（Phytophthorapalmivora）属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)。棕榈疫霉菌是农业生产上的一种危害极为严重的病原菌。棕榈疫霉菌寄主范围十分广泛，能侵染包括果树、林木、花卉等在内的百余种植物，其可侵染植物根、茎、叶、花及果实等各个部位，在气候潮湿的条件下发病更为严重。由其侵染引起的植物病害分布广泛，常给农业作物（如菠萝、番木瓜、榴莲、木薯和橡胶树等）造成重大损失，如由棕榈疫霉菌侵染引起的榴莲根茎腐烂病是一种危害榴莲生产的重要病害，严重年份果园发病达70%，其中果实上的发病率达40%-50%，受棕榈疫霉侵染的榴莲果实果皮变褐，果肉颜色呈深黄色，香味变淡，食用性降低。目前对棕榈疫霉菌引起的病害还没有快速有效的防治措施，控制该病菌病害最有效的途径就是加强检疫，防止病原菌的传播和阻碍其扩散方式。新西兰和澳大利亚曾分别对泰国榴莲进行风险评估，新西兰将榴莲上的棕榈疫霉列为控制性有害生物，澳大利亚把榴莲上的棕榈疫霉视为有风险的潜在有害生物。在我国，棕榈疫霉虽然未列入检疫性有害生物名录，但在引进种子、苗木检疫中，棕榈疫霉往往被列为禁止携带的有害生物。所以建立棕榈疫霉菌的快速分子检测技术对于保护我国农林业生产的安全及棕榈疫霉菌病害的早期控制具有重要意义。棕榈疫霉菌传统的检测方法是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，来确定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是易遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的暴发，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要。随着分子生物学技术的发展，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外研究人员主要利用rDNA/ITS序列设计特异引物来对植物病原菌进行快速检测、鉴定。然而疫霉属卵菌的分子检测技术研究结果表明，rDNA/ITS在疫霉属的近缘种之间变化很小，从ITS序列上设计引物很难将两个相似度高的种区分开；因此要对疫霉属病原菌进行高灵敏性和特异性检测，应从疫霉菌其它基因上设计引物进行检测。已有研究表明，疫霉属中Ras家族相关的Ypt1编码基因含有多个外显子和内含子，外显子具有保守性，而这些内含子在不同种之间具有多变性，非常适合于设计引物进行疫霉属卵菌近缘种的特异性分子检测、鉴定。目前尚无针对Ypt1基因设计的特异性引物检测棕榈疫霉菌的报道。本专利技术根据棕榈疫霉菌Ypt1基因序列信息设计特异引物，不仅能特异鉴定该病原菌，而且可直接用于发病组织和土壤中病菌的检测，这将对棕榈疫霉菌病害的早期诊断具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中对棕榈疫霉菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有分子检测中rDNA-ITS序列差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将一些近缘种的病原菌区分开的技术缺欠，提供了棕榈疫霉菌特异性PCR检测引物对及其检测方法；利用本专利技术所述的PCR检测引物对和检测方法检测棕榈疫霉菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：1.通过测定棕榈疫霉菌（Phytophthorapalmivora）和其它疫霉菌（Phytophthoraspp）的Ypt1基因序列，对疫霉属不同种间Ypt1基因序列进行比对分析，设计出一种用于检测棕榈疫霉菌的引物对，该引物对特异性强，其核苷酸序列为：上游引物PPF：5'-GCAAAAGTGTTGATGGTTTGG-3'，下游引物PPR：5'-CTTGACTAGGAACGCCTGGA-3'；该引物对的扩增产物大小约为220bp。2.本专利技术的另一目的在于提供一种利用上述引物对检测棕榈疫霉菌检测的方法，包括以下步骤：（1）提取待测样品基因组DNA。用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µL2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2%CTAB；100mmol/LTris-HCl,pH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl）和90µLSDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000r·min-1离心15min；取上清液700µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min-1离心9min；取上清液500µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r·min-1离心5min；取上清液350µL，加入1/10体积3mol·L-1NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min-1离心5min；弃去上清液，加入700µL冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60µLTE（10mmol/LTris-HCl，0.1mmol/LEDTA，pH8.0）溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至100ng/µL待用。用于检测植物组织中存在棕榈疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL0.5mol/LNaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5µl加入495µL0.1mol/LTris-HCl（pH=8.0）混合均匀，取1.0µL作为PCR模板进行扩增；用于检测土壤样品中存在棕榈疫霉菌时，采用土壤DNA提取试剂盒，提取DNA。（2）PCR扩增反应：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用PPF/PPR这一对引物进行PCR扩增。PCR反应体系25µL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5µL，10µmol/L的PPF/PPR引物各1.0µL，DNA模板1.0µL，用无菌超纯水补足至25µL；扩增参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。（3）电泳检测：取步骤（2）的PCR扩增产物5.0µL用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，4-5V/cm，电泳40min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约220bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在棕榈疫霉菌，否则所述的检测样品中未存在该菌。本专利技术的显著优点本专利技术与现有技术相比，具有以下的技术优势和有益效果：1.特异性强、准确性高：本专利技术能准确地检测、鉴定出棕榈疫霉菌，只有棕榈疫霉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测棕榈疫霉菌的引物对，其特征在于所述引物序列为：上游引物PPF：5'‑ GCAAAAGTGTTGATGGTTTGG ‑3'，下游引物PPR：5'‑ CTTGACTAGGAACGCCTGGA ‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测棕榈疫霉菌的引物对，其特征在于所述引物序列为：上游引物PPF：5'-GCAAAAGTGTTGATGGTTTGG-3'，下游引物PPR：5'-CTTGACTAGGAACGCCTGGA-3'。2.一种利用权利要求1所述引物对检测棕榈疫霉菌的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）提取待检测样品基因组DNA；（2）PCR扩增反应：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用PPF/PPR引物对进行PCR扩增，PCR扩增的条件为：PCR反应体系25µL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5µL，10µmol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮宏椿，兰成忠，姚锦爱，吴玮，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35