一种掘氏疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法技术

本发明专利技术公开了一种掘氏疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。该LAMP检测引物组合物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成。本发明专利技术的检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好、实现了恒温扩增，同时还为掘氏疫霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于掘氏疫霉菌的高灵敏度快速检测，同时在病害侵染初期鉴定出病原物，能够对田间土壤中的掘氏疫霉菌进行检测。本发明专利技术对掘氏疫霉菌引起的疫病防治和对减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种掘氏疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种掘氏疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。
技术介绍
掘氏疫霉(Phytophthoradrechsleri)早是在1931年由Drechsler从马铃薯块茎上分离得到。掘氏疫霉在我国是1982年报道的，可以侵染黄瓜的一个新种。目前掘氏疫霉侵染引起的植物疫病是一种世界性分布的土传毁灭性病害，危害寄主广泛，常给多种经济作物(如黄瓜、甜菜、马铃薯、雪松等)的生产带来严重损失。掘氏疫霉菌属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)。掘氏疫霉菌引起的植物病害分布广泛，所以建立掘氏疫霉菌的快速分子检测技术对于其引起疫病的早期控制具有重要意义。目前对该病害还没有快速有效的防治措施，控制该病的最有效途径就是加强检疫，防止病原菌的传播和阻碍其扩散方式。传统的掘氏疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统方法在掘氏疫霉菌检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。随着分子生物学的发展，PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势。普通PCR的方法已经成功用于检测掘氏疫霉菌，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时PCR法依赖精密的温度循环装置，其检测灵敏度比较高、检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种新的核酸扩增技术，因其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物--白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立14年以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，但在植物病原卵菌的检测报道很少，掘氏疫霉菌的检测国内外均未见报道。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中掘氏疫霉菌生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本专利技术的目的是提供一种掘氏疫霉菌的LAMP检测引物组合物。本专利技术的另一目的是提供上述掘氏疫霉菌的LAMP检测试剂盒。本专利技术另一目的是提供上述掘氏疫霉菌的LAMP检测方法。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种用于检测掘氏疫霉菌的LAMP检测引物组合物：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：FIP：5′-CGGATTTTCTAGAACGTGGTACCAA-AATGAAGAGTCGACTCTAGCA-3′；BIP：5′-ACTATTGAGCTGGACGGCAA-TCGATAGCAGCCCAAGAG-3′；F3：5′-GTGATCCTTTCACCCTGG-3′；B3：5′-TTACAAATGTCAGCTGGATG-3′；LB：5′-TGTACGTCTACAGAGGATTTGGAT-3′。所述的LAMP检测引物组合物在检测掘氏疫霉菌中的应用。一种检测掘氏疫霉菌的LAMP检测试剂盒：包含1mL检测溶液，所述的检测溶液包括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM环引物LB、48mMdNTPs、0.8MTris-HC、0.4mMKCl、0.4mM(NH4)2SO4、0.24mMMgSO4、4％TritonX-100、BstDNApolymerase320单位，200mM羟基萘酚蓝；其中，各引物序列具体如下：FIP：5′-CGGATTTTCTAGAACGTGGTACCAA-AATGAAGAGTCGACTCTAGCA-3′；BIP：5′-ACTATTGAGCTGGACGGCAA-TCGATAGCAGCCCAAGAG-3′；F3：5′-GTGATCCTTTCACCCTGG-3′；B3：5′-TTACAAATGTCAGCTGGATG-3′；LB：5′-TGTACGTCTACAGAGGATTTGGAT-3′。所述的检测掘氏疫霉菌的LAMP试剂盒在检测掘氏疫霉菌中的应用。一种检测掘氏疫霉菌的LAMP检测方法：包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用LAMP检测引物组合物或LAMP检测试剂盒进行LAMP；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在特征性阶梯状条带，则证明所检测样品中存在掘氏疫霉菌；无特征性阶梯状条带，则所检测样品中无掘氏疫霉菌；或观察LAMP反应溶液颜色变化，天蓝色表示阳性结果，存在掘氏疫霉菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在掘氏疫霉菌。所述的检测掘氏疫霉菌的LAMP检测方法：提取待检微生物的DNA，取1μLDNA溶液，加入23μLLAMP试剂盒中的检测溶液和1μL灭菌去离子水进行LAMP，LAMP反应程序为：60℃～65℃，60～80min。本专利技术的检测掘氏疫霉菌的方法，包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP；羟基萘酚蓝(hydroxylnaphtholblue，HNB)属于金属离子指示剂的一种。HNB是Mg2+的滴定剂，其颜色随溶液PH变化而改变，因此可以通过监测LAMP反应体系中Mg2+浓度的变化及溶液PH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg2+与LAMP反应的副产物P2O74-结合产生大量沉淀，溶液中Mg2+浓度降低，pH发生变化，从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断掘氏疫霉菌的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在掘氏疫霉菌；紫色表示检测结果为阴性，不存在掘氏疫霉菌。本专利技术的关键性技术之一是掘氏疫霉菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证掘氏疫霉菌的特异性引物序列，本专利技术以8株掘氏疫霉菌菌株和14种其它卵菌以及17种病原真菌为供试材料(表1)，采用CTAB法提取发病组织中掘氏疫霉菌的DNA。具体方法如下：取少量菌丝粉，加900μL2％CTAB提取液和90μL10％SDS，漩涡混匀，于55℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测掘氏疫霉菌的LAMP引物组合物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：FIP：5′‑ CGGATTTTCTAGAACGTGGTACCAA‑AATGAAGAGTCGACTCTAGCA ‑3′；BIP：5′‑ ACTATTGAGCTGGACGGCAA‑TCGATAGCAGCCCAAGAG‑3′；F3：5′‑ GTGATCCTTTCACCCTGG ‑3′；B3：5′‑ TTACAAATGTCAGCTGGATG ‑3′；LB：5′‑ TGTACGTCTACAGAGGATTTGGAT ‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测掘氏疫霉菌的LAMP引物组合物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：FIP：5′-CGGATTTTCTAGAACGTGGTACCAA-AATGAAGAGTCGACTCTAGCA-3′；BIP：5′-ACTATTGAGCTGGACGGCAA-TCGATAGCAGCCCAAGAG-3′；F3：5′-GTGATCCTTTCACCCTGG-3′；B3：5′-TTACAAATGTCAGCTGGATG-3′；LB：5′-TGTACGTCTACAGAGGATTTGGAT-3′。2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测掘氏疫霉菌中的应用。3.一种检测掘氏疫霉菌的LAMP试剂盒，其特征在于：包含1mL检测溶液，所述的检测溶液包括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴婷婷，叶建仁，吴小芹，陈宏健，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32