一种从固体培养基中提取荔枝霜疫霉菌卵孢子的便捷方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种从固体培养基中提取较纯净荔枝霜疫霉菌卵孢子的便捷方法。本发明专利技术方法通过在固体培养基表面覆盖尼龙薄膜后再于尼龙薄膜表面接种荔枝霜疫霉菌，按常规方法培养后，撕开薄膜，从固体培养基中得到荔枝霜疫霉卵孢子。本发明专利技术方法通过在培养基表面覆盖尼龙薄膜后再接种荔枝霜疫霉菌进行培养，菌丝基本生长在尼龙薄膜表面，而只有少量透过薄膜生长于培养基表面，且培养基表面菌落生长良好，含有大量卵孢子，撕开薄膜即可基本实现菌丝与荔枝霜疫霉卵孢子的分离，在固体培养基中获得大量、纯净且具有活力的荔枝霜疫霉卵孢子。本发明专利技术方法能快捷获得大量、纯净且具有活力的卵孢子，大大提高开发对卵孢子研究的可能性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，特别涉及一种从固体培养基中提取较纯净荔枝霜疫霉菌卵孢子的便捷方法。
技术介绍
荔枝霜疫霉病(PeronophythoralitchiiChenexKoetal.)是由荔枝霜疫霉菌引起的一种不仅能在田间为害荔枝嫩叶、枝条、花穗及幼果还能在成熟果实采摘后的运输及贮藏过程中造成烂果的重大病害。该病的病原菌隶属卵菌，虽有类似真菌的菌丝体但其分类地位距真菌较远而与藻类更为相近，故一般的杀真菌剂对其防治效果不佳。荔枝霜疫霉菌有着无性生殖与有性生殖两个阶段，该病的传播与流行主要依靠其无性阶段，即菌丝顶端膨大形成孢子囊，孢子囊遇低温高湿条件则脱离菌丝并释放游动孢子，游动孢子游动寻找寄主并休止形成休止孢，休止孢定植后萌发进而形成菌丝进行侵染，菌丝又可继续形成孢子囊，这样持续循环着；该病原菌依靠有性生殖形成厚壁而富含营养物质的卵孢子帮助其度过逆境，因此，卵孢子作为次年病害发生的主要初侵染源是荔枝霜疫霉菌生活史中非常重要的一个阶段。荔枝霜疫霉菌是同宗配合的，所以单一的菌株中不同的菌丝便可分别分化形成藏卵器与雄器并进行配合。卵孢子通常在营养贫瘠时或较为老化的菌丝之间形成。在实验室条件下将荔枝霜疫霉菌培养于胡萝卜固体培养基上，25℃黑暗培养7～10天，便可在培养基内部镜检到大量的卵孢子，且发现卵孢子大多集中形成在接种点周围，并以接种点为中心有向外扩张形成的趋势。目前关于卵孢子的研究比较少，一方面可能是由于其通常为休眠状态的过度阶段而甚少被关注；另一方面可能是由于其形成周期较长、萌发条件较苛刻及形成于培养基内部提取较困难而不易被研究。因此，卵孢子作为卵菌病害循环中重要的中心环节之一，应当引起国内外研究者的广泛关注。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种从固体培养基中提取较纯净荔枝霜疫霉菌卵孢子的便捷方法。本专利技术方法有效减少卵孢子的收集过程难度，操作简单、获得的卵孢子材料较多且较纯净，大大提高开发对卵孢子研究的可能性。本专利技术的目的通过下述方案实现：一种从固体培养基中提取较纯净荔枝霜疫霉菌卵孢子的便捷方法，其通过在固体培养基表面覆盖尼龙薄膜后再于尼龙薄膜表面接种荔枝霜疫霉菌，按常规方法培养后，撕开薄膜，从固体培养基中得到荔枝霜疫霉卵孢子。所述的常规方法培养可为在25℃黑暗培养7～10天。所述的固体培养基可为本领域常规使用的固体培养基即可，优选为胡萝卜培养基。所述的尼龙薄膜优选为HybondTMN+膜。所述的荔枝霜疫霉菌接种前优选先进行活化。所述活化采用常规方法即可，如在固体培养基中25℃培养4天。所述的从固体培养基中得到荔枝霜疫霉卵孢子既可通过利用刀具等刮划培养基表面使荔枝霜疫霉卵孢子脱落，也可通过将含有荔枝霜疫霉卵孢子的培养基加水后匀浆获得。本专利技术研究发现，通过在培养基表面覆盖尼龙薄膜后再接种荔枝霜疫霉菌进行常规培养，菌丝基本生长在尼龙薄膜表面，而只有少量透过薄膜生长于培养基表面，且培养基表面菌落生长良好，含有大量卵孢子，撕开薄膜即可基本实现菌丝与荔枝霜疫霉卵孢子的分离，只需用灭菌的刀片轻轻刮划培养基，即可从固体培养基中获得大量、纯净且具有活力的荔枝霜疫霉菌卵孢子。本专利技术亦可用常规的方法从培养基中分离卵孢子，即在离接种点10mm的区域内随机切取3块大小为10mm×10mm的菌丝块，置于5mL的离心管中，加入3mL的去离子水，用高速匀浆机(6000rpm)匀浆2min(Flieretal.，2001)。虽然此法也能获得大量的卵孢子，但固体培养基仍然存在，仪器设备上有所要求且操作不如用刀片刮划的方法方便，使用者可根据实验的需求来确定最终如何收集卵孢子。而现有技术培养荔枝霜疫霉菌时，由于菌丝与卵孢子同时生长于培养基中，给卵孢子的分离和提取带来了极大的困难。本专利技术方法有效解决了上述问题。本专利技术方法能快捷地从胡萝卜固体培养基中分离出大量、纯净且具有活力的卵孢子，能很好的为研究卵菌尤其是卵孢子生物学特性与分子生物学相关的研究者提供快速大量收集研究材料的方法，大大提高开发对卵孢子研究的可能性。附图说明图1为荔枝霜疫霉菌在覆盖不同膜的胡萝卜固体培养基平板上的菌落图。图2为荔枝霜疫霉菌在覆盖不同膜的胡萝卜固体培养基平板上的菌落直径统计结果。图3为覆盖HybondTMN+膜处理与不覆盖膜对照的胡萝卜培养基中荔枝霜疫霉菌卵孢子产量的统计结果。图4为覆盖HybondTMN+膜处理与不覆盖膜对照的胡萝卜培养基中荔枝霜疫霉菌卵孢子活力的统计结果。图5为覆盖HybondTMN+膜处理与不覆盖膜对照的胡萝卜培养基中荔枝霜疫霉菌卵孢子分别在显微镜物镜5×、10×、20×与40×下镜检染色情况。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。下列实施例中使用的试剂均可从商业渠道获得。实施例1：荔枝霜疫霉菌在不覆盖膜/覆盖不同类型膜的胡萝卜固体培养基上的生长速率胡萝卜培养基的制备：称取200g胡萝卜，用榨汁机充分榨汁后用16层纱布过滤，滤液补足水分至1000mL，再加15g琼脂，充分加热溶解后分装于锥形瓶(每瓶100mL培养液)，121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。活化荔枝霜疫霉菌SHS-3(NCBI，BioProjectID:PRJNA290406)于胡萝卜培养基，25℃培养4天后，用打孔器于菌落边缘打孔，将菌碟分别接种于不覆盖膜、覆盖玻璃纸、覆盖硝酸纤维素膜以及覆盖HybondTMN+膜的胡萝卜固体培养基上，置于25℃黑暗培养10天。以不覆盖膜为对照，每种膜处理均重复3次。结果发现在覆盖玻璃纸与硝酸纤维素膜的培养基中，荔枝霜疫霉菌生长受到明显抑制，菌落直径明显小于不覆盖膜对照处理的菌落直径，且撕下玻璃纸与硝酸纤维素膜后发现霜疫霉菌仅在接种点附近有少许菌丝；而生长在覆盖HybondTMN+膜的胡萝卜培养基上的荔枝霜疫霉菌株菌落直径与对照处理相比无明显差异，且撕下膜后发现荔枝霜疫霉菌长满整个培养皿，培养基表面气生菌丝明显少于不覆盖膜的对照处理(见图1，图2)。实施例2：不同类型的膜覆盖的胡萝卜培养基中卵孢子的生长情况荔枝霜疫霉菌的培养同实施例1。将膜撕下后，分别在对照组与不同膜处理组接种点附近切取0.5cm×0.5cm大小的菌块，压片并计数卵孢子的数量，实验重复3次。结果发现，与不覆盖膜的对照相比，覆盖玻璃纸与覆盖硝酸纤维素膜处理的胡萝卜培养基中卵孢子数量显著减少，而覆盖HybondTMN+膜处理的胡萝卜培养基中的卵孢子数量无明显差异(见图3)。实施例3：覆盖HybondTMN+膜处理的胡萝卜培养基中卵孢子活力的测定荔枝霜疫霉菌的培养同实施例1。用MTT(tetrazoliumbromide，噻唑蓝)染色法测定卵孢子存活力。用灭菌去离子水配制浓度为0.1％MTT，过滤灭菌后与卵孢子悬浮液等体积混合，于36℃下培养2d，镜检结果。被染桃红色或蓝色的是有活力的，没被染色或呈黑色的则是无活力的(Sutherlandetal.，1983)。结果发现覆盖HybondTMN+膜处理的胡萝卜培养基中的卵孢子有活力的比例与不覆盖膜的对照相比无明显差异(见图4，图5)。上述结果表明本专利技术方法既可有效、快捷分离提取卵孢子，又不会对其生长、活力等产生不良影响，能很好的为研本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从固体培养基中提取较纯净荔枝霜疫霉菌卵孢子的便捷方法，其特征在于通过在固体培养基表面覆盖尼龙薄膜后再于尼龙薄膜表面接种荔枝霜疫霉菌，按常规方法培养后，撕开薄膜，从固体培养基中得到荔枝霜疫霉卵孢子。

【技术特征摘要】
1.一种从固体培养基中提取较纯净荔枝霜疫霉菌卵孢子的便捷方法，其特征在于通过在固体培养基表面覆盖尼龙薄膜后再于尼龙薄膜表面接种荔枝霜疫霉菌，按常规方法培养后，撕开薄膜，从固体培养基中得到荔枝霜疫霉卵孢子。2.根据权利要求1所述的从固体培养基中提取较纯净荔枝霜疫霉菌卵孢子的便捷方法，其特征在于：所述的尼龙薄膜为HybondTMN+膜。3.根据权利要求1所述的从固体培养基中提取较纯净荔枝霜疫霉菌卵孢子的便捷方法，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：习平根，司徒俊键，万琅，孔祥宇，朱子钦，孔广辉，江立群，徐丹丹，姜子德，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44