用于测定大豆疫霉菌无毒基因Avr3a对鉴别寄主L83-570致病性的分子方法技术

本发明专利技术涉及用于测定大豆疫霉菌无毒基因Avr3a对鉴别寄主L83-570致病性的分子方法，提取待检测大豆疫霉菌的基因组DNA；PCR扩增出包括完整无毒基因Avr3a的DNA片段；用限制性内切酶BmgBI酶切扩增出的DNA片段；对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳图在250bp-500bp范围内有2条DNA条带，则对应的待检测大豆疫霉菌菌株对鉴别寄主L83-570表现为不致病，酶切后在750bp以下有1条DNA条带，则对应的待检测大豆疫霉菌菌株对鉴别寄主L83-570表现为致病。该方法测定周期短、无中间类型，可同时测定多株大豆疫霉菌无毒基因Avr3a对鉴别寄主L83-570的致病性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及涉及一种分子测定方法，尤其涉及用于测定大豆疫霉菌无毒基因Avr3a对鉴别寄主L83-570致病性的分子方法。
技术介绍
大豆疫霉菌侵染大豆引起的大豆根腐病是世界范围内威胁大豆生产的主要病害之一。大豆根腐病于1948年在美国的印地安那州首次被发现，而后在大豆的主要生产国都相继发现了该病害。我国1989年由沈崇尧和苏彦纯首次在东北大豆主产区分离到大豆疫霉菌，之后在黑龙江省、吉林省和北京市也相继发现有大豆疫霉菌，近几年山东、安徽、河南、江苏、浙江、内蒙古、湖北、福建、新疆、四川、天津和贵州等15个省(市区)也相继被报道分离鉴定到大豆疫霉菌。其中在黑龙江和福建两省发生较为严重，目前仍是我国重要的对外检疫对象。大豆疫霉菌的进化速度较快，生理小种分化十分复杂，美国目前已鉴定到55个生理小种和更多未正式定名生理小种的致病型；我国已发现1号、3号、8号、9号、11号、15号、17号、21号、24号等10个生理小种，其中1号生理小种为黑龙江省的优势小种，同时也鉴定到大量的未定名生理小种的致病型。目前防治大豆疫霉根腐病最有效的方法是种植抗病品种，而想要准确使用大豆抗病品种就需要明确待检测大豆疫霉菌(指定地区分离的大豆疫霉菌)的毒性组成(即生理小种的组成)；而目前生理小种的测定主要采用带有14个抗病基因(Rps1a,Rps1b,Rps1c,Rps1d,Rps1k,Rps2,Rps3a,Rps3b,Rps3c,Rps4,Rps5,Rps6,Rps7和Rps8)的一套近等基因系鉴别寄主进行下胚轴创伤接种测定，该方法虽然简单易行，但测定周期长、工作强度大、容易出现中间类型，不适合高通量的生理小种鉴定；因此寻求一种能够快速、准确、高通量测定大豆疫霉菌毒性组成的方法是本领域亟待解决的技术问题。与本专利技术相关的公知常识：公知常识(1)：病原菌携带有无毒基因或毒性基因，鉴别寄主携带有抗病基因或感病基因，其中无毒基因与毒性基因是一对等位基因，抗病基因和感病基因是一对等位基因；当携带有无毒基因的病原菌侵染携带有对应抗病基因的鉴别寄主时，抗病基因与无毒基因互作使鉴别寄主表现为抗病；当携带有无毒基因的病原菌侵染携带有感病基因的鉴别寄主时，鉴别寄主表现为感病；当携带有毒性基因的病原菌侵染鉴别寄主时，不管鉴别寄主是否携带有抗病基因，均表现为感病。公知常识(2)：对于无毒基因与抗病基因的命名，国际上通常是先命名无毒基因，并将能与无毒基因互作使鉴别寄主表现为抗病的基因命名为对应的抗病基因；即理论上可能会存在多个抗病基因与同一个无毒基因互作的情况，而实际上也确实如此，例如国际上最初认为大豆疫霉中的无毒基因Avr4和Avr6分别与大豆中的抗病基因Rps4和Rps6互作，但进一步的研究发现Avr4和Avr6实际上是同一个基因，改名为Avr4/6，抗病基因Rps4和Rps6均能与无毒基因Avr4/6互作，分别识别无毒基因Avr4/6的不同部位来引发抗病反应，由公知常识(2)分析，理论上可能会存在多个抗病基因与无毒基因Avr3a互作，即来源于不同抗病材料的抗病基因Rps3a可能是完全不同的抗病基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于测定大豆疫霉菌无毒基因Avr3a对鉴别寄主L83-570致病性的分子方法，该方法测定周期短、无中间类型、准确可靠，可同时测定多株大豆疫霉菌无毒基因Avr3a对鉴别寄主L83-570的致病性；为快速、准确、高通量测定大豆疫霉菌毒性组成奠定了基础。为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案是：用于测定大豆疫霉菌无毒基因Avr3a对鉴别寄主L83-570致病性的分子方法，采用CTAB法提取待检测大豆疫霉菌的基因组DNA；然后设计一对特异性引物并以提取的基因组DNA为模版进行PCR扩增，所述的一对特异性引物分别结合在无毒基因Avr3a的上游和下游，从而使PCR扩增出的DNA片段包括完整的无毒基因Avr3a；用限制性内切酶BmgBI酶切扩增出的DNA片段，得到酶切产物；对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；观察酶切产物琼脂糖凝胶电泳图，如果在250bp-500bp范围内有2条DNA条带，则对应的待检测大豆疫霉菌菌株对鉴别寄主L83-570表现为不致病；如果酶切后在750bp以下有1条DNA条带，则对应的待检测大豆疫霉菌菌株对鉴别寄主L83-570表现为致病。进一步地，所述的一对特异性引物为AVR3A1F/AVR3A1R，其碱基序列分别为：AVR3A1F：5ˊ-ATCGAAGCCATATATCTACAGG-3ˊ；AVR3A1R：5ˊ-CCTACTGTATGCAAAGTGATCG-3ˊ。进一步地，所述CTAB法提取待检测大豆疫霉菌基因组DNA的具体步骤为：(1)从培养5-7天的待检测大豆疫霉菌菌落边缘切取10-20块直径2×2mm菌丝块，移入装有100ml澄清的10％V8液体培养基的三角瓶中，置于25℃黑暗条件下、120r/min震荡培养5-7天，培养好的菌丝体用灭菌双层纱布过滤收集，蒸馏水冲洗1次，经冷冻干燥后充分捣碎成菌丝粉；(2)取50mg的菌丝粉于1.5mlEP管中，加入900μl质量浓度为2％的CTAB提取液和90μl质量浓度为10％的SDS水溶液后漩涡混合器上充分混匀；(3)55-60℃水浴1h,每15min振荡混匀一次；(4)12000r/min离心10min，取上清液A，加入苯酚、氯仿和异戊醇三者的混合物抽提1次，所加入的苯酚、氯仿和异戊醇三者的混合物中苯酚、氯仿和异戊醇的重量比为25:24:1，苯酚、氯仿和异戊醇三者混合物的体积与上清液A的体积相等；(5)12000r/min离心10min，吸取上清液B，加入氯仿抽提1次，所加入氯仿的体积与上清液B的体积相等；(6)12000r/min离心10min，吸取上清液C，加入3mol/L的NaAc水溶液和冰无水乙醇过夜沉淀基因组DNA，所加入NaAc水溶液和冰无水乙醇与上清液C的体积比为0.1:2:1；(7)用预冷的体积比为70％的乙醇水溶液洗涤两次，然后置于37℃条件下干燥；(8)干燥后的DNA用100μl含50μg/ml核糖核酸酶的ddH2O溶解，37℃静置1h后，置于-20℃冰箱中备用。进一步地，所述PCR扩增的扩增体系和扩增条件分别为：扩增体系：稀释10倍的PCR反应缓冲液，2.5μl；2.5mmol/L的MgCl2，1.5μl；2.5mmol/L的dNTPs，0.5μl；5U/μl的TaqDNA聚合酶，0.2μl本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于测定大豆疫霉菌无毒基因Avr3a对鉴别寄主L83‑570致病性的分子方法，其特征在于：采用CTAB法提取待检测大豆疫霉菌的基因组DNA；然后设计一对特异性引物并以提取的基因组DNA为模版进行PCR扩增，所述的一对特异性引物分别结合在无毒基因Avr3a的上游和下游，从而使PCR扩增出的DNA片段包括完整的无毒基因Avr3a；用限制性内切酶BmgBI酶切扩增出的DNA片段，得到酶切产物；对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；观察酶切产物琼脂糖凝胶电泳图，如果在250bp‑500bp范围内有2条DNA条带，则对应的待检测大豆疫霉菌菌株对鉴别寄主L83‑570表现为不致病；如果酶切后在750bp以下有1条DNA条带，则对应的待检测大豆疫霉菌菌株对鉴别寄主L83‑570表现为致病。

【技术特征摘要】
1.用于测定大豆疫霉菌无毒基因Avr3a对鉴别寄主L83-570致病性的分子方法，其特征在于：采用CTAB法提取待检测大豆疫霉菌的基因组DNA；然后设计一对特异性引物并以提取的基因组DNA为模版进行PCR扩增，所述的一对特异性引物分别结合在无毒基因Avr3a的上游和下游，从而使PCR扩增出的DNA片段包括完整的无毒基因Avr3a；用限制性内切酶BmgBI酶切扩增出的DNA片段，得到酶切产物；对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；观察酶切产物琼脂糖凝胶电泳图，如果在250bp-500bp范围内有2条DNA条带，则对应的待检测大豆疫霉菌菌株对鉴别寄主L83-570表现为不致病；如果酶切后在750bp以下有1条DNA条带，则对应的待检测大豆疫霉菌菌株对鉴别寄主L83-570表现为致病。
2.根据权利要求1所述的用于测定大豆疫霉菌无毒基因Avr3a对鉴别寄主L83-570致病性的分子方法，其特征在于：所述的一对特异性引物为AVR3A1F/AVR3A1R，其碱基序列分别为：
AVR3A1F：5ˊ-ATCGAAGCCATATATCTACAGG-3ˊ；
AVR3A1R：5ˊ-CCTACTGTATGCAAAGTGATCG-3ˊ。
3.根据权利要求2所述的用于测定大豆疫霉菌无毒基因Avr3a对鉴别寄主L83-570致病性的分子方法，其特征在于：所述CTAB法提取待检测大豆疫霉菌基因组DNA的具体步骤为：
（1）从培养5-7天的待检测大豆疫霉菌菌落边缘切取10-20块直径2×2mm菌丝块，移入装有100ml澄清的10%V8液体培养基的三角瓶中，置于25℃黑暗条件下、120r/min震荡培养5-7天，培养好的菌丝体用灭菌双层纱布过滤收集，蒸馏水冲洗1次，经冷冻干燥后充分捣碎成菌丝粉；
（2）取50mg的菌丝粉于1.5mlEP管中，加入900μl质量浓度为2%的CTAB提取液和90μl质量浓度为10%的SDS水溶液后漩涡混合器上充分混匀；
（3）55-60℃水浴1h,每15min振荡混匀一次；
（4）12000r/min离心10min，取上清液A，加入苯酚、氯仿和异戊醇三者的混合物抽提1次，所加入的苯酚、氯仿和异戊醇三者的混合物中苯酚、氯仿和异戊醇的重量比为25:2...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔林开，胡艳红，周洲，李永丽，郑伟，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41