一种鉴定落叶型棉花黄萎病菌的方法技术

本发明专利技术涉及棉花黄萎病菌的鉴定，具体涉及一种鉴定落叶型棉花黄萎病菌的方法。所述方法包括步骤：(1)待测棉花黄萎病菌的分离、单孢纯化；(2)对待测菌株进行生物测定；(3)利用特异引物对待测菌株进行分子检测；(4)落叶型黄萎病菌的评价。根据本发明专利技术的方法不选用特定的耐病品种为鉴别寄主，以方便使用者根据当地情况采用当地的耐病品种，鉴别周期短，结果比较客观、全面、可靠。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定落叶型棉花黄萎病菌的方法
本专利技术涉及棉花黄萎病菌的鉴定，具体涉及一种鉴定落叶型棉花黄萎病菌的方法。
技术介绍
黄萎病被称为棉花的癌症，是为害棉花的一种毁灭性病害。近20年来，该病在我国各地频繁流行危害，如1993年、1995年、1996年、2002年、2003年黄萎病即在我国各棉区大发生，有时还造成大面积棉花落叶枯死。黄萎病已发展成为棉花可持续生产的主要障碍之一。培育抗病品种是防治该病的主要方法，但由于黄萎病病菌变异频繁，导致病原菌的致病机制、寄主的抗病机制、及病原菌与寄主的互作机制等研究滞后，严重限制抗病品种的选育，且往往导致现有的抗性不高的耐病品种丧失抗性，因此研究病原菌的遗传变异是该病综合防治及相关研究的基础。棉花黄萎病的致病菌为大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)。我国的棉花黄萎病菌划分为三个生理型：生理型I，致病力最强，以陕西泾阳菌系为代表；生理型II，致病力弱，以新疆和田、车排子菌系为代表；生理型III，致病力中等，广泛分布于长江和黄河流域棉区。80年代初，陆家云等首次报道在我国江苏局部地区出现落叶型棉花黄萎病，其典型症状是叶片轻度萎蔫，很快脱落，植株枯死前即成光杆。之后，落叶型菌株一直受国内科研及技术推广部门的广泛关注，也成为棉花抗黄萎病综合防治及抗病育种等研究的核心。对于落叶型棉花黄萎病菌的鉴定，国内外有不同的方法，但一直没有统一、规范、易操作，能反应病原菌的真实特性，并得到广泛认可的方法。根据河北、湖北、江苏的鉴定，当地近年来新分离黄萎病菌系90％以上是落叶型菌系，对当地棉花可持续生产构成巨大威胁。但是，在各地分离鉴定落叶型黄萎病菌系时经常出现落叶型菌系的致病力并不强的现象，以病情指数判定甚至还不如中等致病力菌系，如何划分和判定从黄萎病病株中分离获得的病原菌为落叶型黄萎病菌，是困扰棉花病害工作者的主要问题，明确落叶型黄萎病菌的鉴定标准对该病的防治和病理学具有重要的指导意义，本专利技术就棉花黄萎病病菌落叶型菌系的划分提出一种综合评判方法，以期为棉花黄萎病的控制技术及抗病育种提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用分子检测结合生物测定鉴定落叶型棉花黄萎病菌的方法。根据本专利技术的一种鉴定落叶型棉花黄萎病菌的方法包括以下步骤：(1)待测棉花黄萎病菌的分离、单孢纯化；(2)将步骤(1)纯化后的黄萎病菌接种现有感病、耐病寄主品种，对待测菌株进行生物测定；(3)利用特异引物对待测菌株进行分子检测，采用落叶型菌株特异引物D-1/D-2：CATGTTGCTCTGTTGACTGG/GACACGGTATCTTTGCTGAA，非落叶型菌株特异引物ND-1/ND-2：CAGGGGATACTGGTACGAGACG/(ATGAGTATTGCCGATAAGAACA对待测菌株进行PCR扩增；(4)落叶型黄萎病菌的评价(4-1)待测菌株人工接种耐病品种后20天内，棉苗出现典型的黄萎病症状并导致真叶脱落；(4-2)待测菌株在感病对照上病情指数达到50时，在耐病品种上的发病率能达到50.0％以上，病情指数能达到耐病品种审定时的病情指数及以上；(4-3)落叶型菌株特异引物D-1/D-2扩展出特异条带，非落叶型菌株特异引物ND-1/ND-2未扩展出特异条带，满足以上三个条件的菌株为棉花黄萎病菌为落叶型菌株。根据本专利技术的具体实施方案，所述方法包括以下步骤：1、棉花黄萎病菌的分离、单孢纯化采集棉花黄萎病病株主茎中下部，剪成小段，去掉表皮并消毒。将棉杆薄片置于PDA培养皿中培养，待薄片周围长出白色菌丝，挑取菌落边缘的稍许菌丝，放入Czapek液体培养基中培养，过滤菌液并均匀涂布于水琼脂平板上，挑取萌发的单个孢子。2、将纯化后的黄萎病菌接种感病、耐病品种，对待测菌株进行生物测定。寄主的黄萎病调查分级标准：0级，棉株健康，无病叶，生长正常；1级，棉株三分之一以下叶片表现病状；2级，棉株三分之一以上，三分之二以下叶片表现病状；3级，棉株三分之二以上叶片表现病状，未枯死；4级，棉株枯死。病株率和病情指数按下面的公式进行计算：病株率＝发病株数/总株数×100％；病情指数＝∑(相应病级×相应病级病株数)/(总株数×4)×100。3、利用特异引物对待测菌株进行分子检测采用大丽轮枝菌(V.dahliae)落叶型菌株特异引物D-1/D-2(CATGTTGCTCTGTTGACTGG/GACACGGTATCTTTGCTGAA)，非落叶型菌株特异引物ND-1/ND-2(CAGGGGATACTGGTACGAGACG/(ATGAGTATTGCCGATAAGAACA)对待测菌株进行PCR扩增，PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，以落叶型菌株T9作为对照菌株。4、落叶型黄萎病菌的评价⑴待测菌株人工接种耐病品种后20天内，棉苗出现典型的黄萎病症状并导致真叶脱落；⑵待测菌株在感病对照上病情指数达到50时，在耐病品种上的发病率能达到50.0％以上，病情指数能达到t及以上的(注：t为耐病品种审定时的病情指数)；⑶落叶型菌株特异引物D-1/D-2能够扩展出特异条带，非落叶型菌株特异引物ND-1/ND-2不能扩展出特异条带。结合生物测定和分子检测结果，满足以上三个条件的菌株为棉花黄萎病菌为落叶型菌株。根据本专利技术的方法具有以下特点：1、不选用特定的耐病品种为鉴别寄主，规定耐病品种的病情指数达到t及以上时即可(注：t为耐病品种审定时公布的病情指数)，以方便使用者根据当地情况采用当地的耐病品种。2、本专利技术的鉴定规定供试菌株在耐病品种上的发病率达到50.0％以上，病情指数达到t及以上，客观的反映病原菌的致病力。3、鉴别周期短。本专利技术的鉴定方法采用蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液的方法，检测病原菌的落叶情况和致病力，寄主接种后7天左右开始发病，25天左右达到鉴定要求(感病对照冀棉11病情指数在40.0～66.7)，鉴定周期为45天左右。4、客观性、全面性。本专利技术结合生物测定和分子测定，即反映了病原菌的致病力、落叶等生物特点，也从基因水平上反映了落叶型和非落叶型菌株的差异。附图说明图1温室致病力测定中的落叶型病株。图2棉花黄萎病菌分子检测示意图。图3D-1/D-2对部分菌株扩增的结(maker2000)。图4ND-1/ND-2对部分菌株扩增的结果(maker2000)。具体实施方式实例一、材料待测菌株；对照菌株，落叶型菌株T9；以国家棉花品种区试验抗病性评价中的感病对照冀棉11、鄂荆1818、新陆早36为本试验的感病对照，以当地种植较为广泛的耐病品种为指示品种。二、生物测定1、待测菌株的分离8月中旬前，采集棉花黄萎病病株主茎中下部，剪成4cm左右的小段，去掉表皮，用75％的酒精消毒。在超净工作台上将去皮的茎杆置于0.1％升汞中浸泡30～60min左右(依据茎干的粗细适当调整消毒时间)，用灭菌的蒸馏水清洗3次，剪成2～3mm的薄片。将薄片置于PDA培养皿中央，于25℃条件下暗培养，2～3d后，薄片周围长出白色菌丝，5～7d后可进一步转皿纯化。从棉花病株上分离到的菌落为野生菌株，挑取野生菌株菌落边缘的稍许菌丝，置PDA平板中央进行初步纯化，25℃下培养10d，然后进行单孢纯化。2、待测菌株单孢纯化挑取上述菌落边缘的少量菌丝，放入Czapek液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定落叶型棉花黄萎病菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)待测棉花黄萎病菌的分离、单孢纯化；(2)将步骤(1)纯化后的黄萎病菌接种现有感病、耐病寄主品种，对待测菌株进行生物测定；(3)利用特异引物对待测菌株进行分子检测，采用落叶型菌株特异引物D‑1/D‑2：CATGTTGCTCTGTTGACTGG/GACACGGTATCTTTGCTGAA，非落叶型菌株特异引物ND‑1/ND‑2：CAGGGGATACTGGTACGAGACG/(ATGAGTATTGCCGATAAGAACA对待测菌株进行PCR扩增；(4)落叶型黄萎病菌的评价(4‑1)待测菌株人工接种耐病品种后20天内，棉苗出现典型的黄萎病症状并导致真叶脱落；(4‑2)待测菌株在感病对照上病情指数达到50时，在耐病品种上的发病率能达到50.0％以上，病情指数能达到耐病品种审定时的病情指数及以上；(4‑3)落叶型菌株特异引物D‑1/D‑2扩展出特异条带，非落叶型菌株特异引物ND‑1/ND‑2未扩展出特异条带，满足以上三个条件的菌株为棉花黄萎病菌为落叶型菌株。

【技术特征摘要】
2016.06.10 CN 20161040703371.一种鉴定落叶型棉花黄萎病菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)待测棉花黄萎病菌的分离、单孢纯化；(2)将步骤(1)纯化后的黄萎病菌接种现有感病、耐病寄主品种，对待测菌株进行生物测定；(3)利用特异引物对待测菌株进行分子检测，采用落叶型菌株特异引物D-1/D-2：CATGTTGCTCTGTTGACTGG/GACACGGTATCTTTGCTGAA，非落叶型菌株特异引物ND-1/ND-2：CAGGGGATACTGGTACGAGACG/(ATGAGTATTGCCGATAAGAACA对待测菌株进行PCR扩增；(4)落叶型黄萎病菌的评价(4-1)待测菌株人工接种耐病品种后20天内，棉苗出现典型的黄萎病症状并导致真叶脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯鸿杰，简桂良，朱荷琴，冯自力，张文蔚，李志芳，赵丽红，师勇强，袁媛，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41