本发明专利技术提供了一种防治大豆疫病的生防放线菌菌株及其应用，属于农作物病害防治技术领域。所述的生防放线菌菌株为禾粟链霉菌(Streptomyces graminearus) St3，已于2014年3月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCCNO.8961。该菌株通过产生活性物质抑制大豆疫霉病菌的生长，对大豆疫病表现出较好的防治效果。应用时在大豆幼苗期或成株期灌根使用。该菌剂也可与有机肥混合制成菌肥使用。本发明专利技术所述的菌株St3是从大豆根围土壤中获得，与土壤生态和谐相容，无毒、无致病性，因此在大豆疫病的生物防治中具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种防治大豆疫病的生防放线菌菌株及其应用，属于农作物病害防治
技术介绍
大豆疫病是由大豆疫霉菌（Phytophthorasojae）侵染引起的大豆生产上的毁灭性病害之一，该病害在大豆的整个生育期均可发生，但尤其以苗期发病最为常见，如果伴有阴雨则易引起病害大面积的流行而造成产量严重下降甚至绝收，防治难度较大，严重影响我国大豆产业发展，造成重大的经济损失。目前，大豆疫病的主要防治方法是栽培抗病品种和喷施化学农药。然而大豆疫霉菌群体会每年都发生巨大的变化，抗性品种抗性一般几年后就会逐渐丧失。目前，科学家已经成功克隆了13个显性单抗病性基因。虽然单基因抗性较强，但是其对大豆疫霉菌选择压力较大，易使新的生理小种成为优势种群，使大豆品种抗性慢慢丧失。化学杀菌剂一度成为控制大豆疫病的主要措施，其中甲霜灵的应用最为广泛。但是，甲霜灵的作用靶标非常单一，大豆疫霉菌在进化过程中极易产生抗性突变，在很多地区抗性菌株频率超过了50%，抗药性问题日益突出。不仅如此，化学农药的大量使用还给生态环境、人类健康等造成严重威胁。因此，研发出可替代化学杀菌剂的生物源杀菌剂用于大豆疫病的防治已刻不容缓。放线菌（Actinomycetes）是一类具有重要经济价值和实用价值的微生物，种类丰富，广泛分布于自然界中。目前从微生物中发现的约8000种生物活性物质当中，近70%是由放线菌产生，特别是链霉菌产生的抗生素在农业生产中应用广泛，如中生菌素、阿维菌素等。土壤拮抗放线菌具有对环境友好、效果持久、针对性强等优点，展现出良好的应用前景。因此从烟田根围土壤分离获得对烟草青枯病菌具有拮抗作用的放线菌，对该病害的防治具有重要意义，符合农业的可持续发展要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：针对目前大豆疫病严重发生，且面积逐年扩大，化学防治效果不理想，同时带来环境污染的问题，提供一种高效防治大豆疫病的生防放线菌及其应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：一种防治大豆疫病的生防放线菌St3，经形态观察、培养特征观察和分子生物学研究鉴定为链霉菌(Streptomycessp.)，已于2014年3月24月保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCCNO.8961。所述的生防放线菌St3菌剂的制备过程如下：将所述的菌株接种于高氏一号液体培养基中，28℃，180r/min，培养2d后，制成种子液。取6ml种子液接种于发酵培养基中。经优化后得到的发酵培养基配方为：淀粉2%、葡萄糖1.5%、黄豆粉2%、NaCl0.3%、CaCO30.2%，其余为水。通过对培养条件的摸索，得到最佳发酵条件为：接种量10%(v/v)、装瓶量60mL/250mL、发酵培养基初始pH值8.0、28℃，200r/min，培养5d，制成浓度为108CFU/ml的St3菌株发酵液。所述的生防放线菌St3在防治大豆疫病中的应用方法如下：可在大豆苗期或成株期灌根使用，每株50ml。连续使用2-3次，每次间隔10天左右。该菌剂也可与有机肥混合配制成菌肥使用。本专利技术有益效果：本专利技术筛选出的生防放线菌St3能够明显抑制大豆疫霉菌的生长。由于是生物制剂，因此没有化学农药的使用带来的一系列问题，对减少农业污染，且能有效防治大豆疫病。本专利技术生防放线菌分离自大豆根围土壤，与土壤生态和谐相容，有利于充分发挥菌株的优势。本专利技术生防放线菌菌株培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。附图说明图1为菌株St3气生菌丝和孢子丝形态（光学显微镜下40×）。图2为菌株St3孢子形态（电子显微镜7000×）。图3为菌株St3发酵液对大豆疫霉菌的平板抑菌效果图。具体实施方式为了更好的理解本专利技术，下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步阐述，但并不是对本专利技术的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例1拮抗放线菌的分离具体过程如下：1、土壤样品的采集从福建省龙海市榜山镇南苑村采集不同大豆地块5-10cm深处的根围土壤，分装标记后带回实验室，待自然风干后分离。、放线菌的分离采用平板稀释法进行分离。称取土壤样品10g，倒入装有小玻璃珠和90ml无菌水的三角瓶中，震荡30min后静置5分钟，依次稀释10倍，分别配制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的悬浮液，吸取不同浓度的悬浮液各0.1ml加到高氏一号培养基（加入终浓度为50mg/L的K2GrO7）平板上，均匀涂布后置于28℃培养观察，5-7天后挑取不同的单菌落划线纯化。将纯化后的菌株转接到高氏一号斜面培养基上培养，4℃保存备用，共分离得到85株放线菌。实施例2菌株St3的鉴定1、形态特征观察将菌株St3划线接种在高氏一号培养基上，以45度角斜插入无菌盖玻片，28℃培养7d后，取出盖玻片在光学显微镜和电子显微镜下观察菌丝和孢子的形态特征。发现菌株St3的孢子丝螺旋状，常成簇生，孢子丝断裂成分生孢子，孢子椭圆形，表面粗糙（图1和图2）。、培养特征观察采用《链霉菌鉴定手册》推荐的8种培养基，将菌株St3于28℃培养7-10d后观察菌体生长情况，记录气生菌丝、基内菌丝的颜色以及是否产生可溶性色素。菌株St3在高氏一号培养基、察贝克培养基、PDA培养基、葡萄糖酵母膏培养基和燕麦培养基上生长良好，基内菌丝和气生菌丝发育良好；而在克氏一号培养基、淀粉铵培养基和葡萄糖天门冬素培养基上生长较差，在上述8种培养基上均无可溶性色素产生(表1)。根据以上形态特征分析，对照链霉菌鉴定手册，将St3初步鉴定为链霉菌粉红孢类群。表1菌株St3在不同培养基上的培养特征3、16SrDNA序列分析基因组提取试剂盒提取菌株St3基因组DNA后，采用通用引物F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，进行16SrDNA的PCR扩增。回收PCR扩增产物，经连接、转化、鉴定后，阳性克隆送生工生物工程（上海）有限公司测序，序列全长为1555bp（请见序列SEQIDNO.1）。将所得序列提交到GenBank数据库进行BLAST分析比对，发现与St3同源性较高的菌株均属于链霉菌属，选取12个典型菌株的16SrDNA序列用MEGA5.0软件构建系统发育树。结果表明，菌株St3与Streptomycesgraminearus属于同一分支，其中与菌株Streptomycesgraminearus相似性达到99.8%，并结合形态学特征和培养特征，将菌株St3鉴定为禾粟链霉菌(Streptomycesgraminearus)。实施例3St3菌株发酵工艺的优化将上述菌株接种于高氏一号液体培养基中，28℃，180r/min，培养2d后，制成种子液。取6ml种子液接种于发酵培养基中。通过对碳源、氮源的筛选以及营养条件单因子试验和正交试验后，得到该菌株的最佳发酵配方为：淀粉2wt.%、葡萄糖1.5wt.%、黄豆粉2wt.%、NaCl0.3wt.%、CaCO30.2wt.%，其余为水。通过对培养条件的摸索，得到最佳发酵条件为：接种量10%(v/v)、装瓶量60mL/250mL、发酵培养基初始pH值8.0本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种防治大豆疫病的生防放线菌菌株，其特征在于，所述的菌株为链霉菌(Streptomyces sp.) St3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年3月24日，保藏号为CGMCC NO. 8961。
【技术特征摘要】
1.一种防治大豆疫病的生防放线菌菌株，其特征在于，所述的菌株为链霉菌(Streptomycessp.)St3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年3月24日，保藏号为CGMCCNO.8961。2.如权利要求1所述的生防放线菌菌株制备的生防菌剂。3.根据权利要求1所述的生防放线菌菌株制备的生防菌剂，其特征在于：生防菌剂的制备方法为：将所述的菌株接种于高氏一号液体培养基中，28℃，180r/min，培养2d后，制成种子液；取6ml种子液接种于发酵培养基中；发酵培养基配方为：淀...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈庆河，李本金，刘裴清，王荣波，翁启勇，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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