板栗疫病菌产孢基因Pro1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种板栗疫病菌产孢基因Pro1及其应用。该基因含有4个外显子和3个内含子，DNA全长1641bp，cDNA全长1416bp，编码471个氨基酸，表达的蛋白质如SEQ.ID.No.3所示，该蛋白可用于调控板栗疫病菌分生孢子的形成。实验证明，Pro1基因被潮霉素抗性基因hph置换后得到的缺失突变体产孢量减少，对高盐和渗透压敏感，在离体板栗树枝上能够形成与野生型大小没有显著差异的致病斑。本发明专利技术对产孢相关基因Pro1的功能研究，对研究板栗疫病菌及相关丝状真菌分生孢子形成的分子机制和对外界环境的响应机制具有重要的理论意义，而且对于研发控制板栗疫病及其它植物病害的候选药物具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种板栗疫病菌产孢基因Pro1及其应用。该基因含有4个外显子和3个内含子，DNA全长1641bp，cDNA全长1416bp，编码471个氨基酸，表达的蛋白质如SEQ.ID.No.3所示，该蛋白可用于调控板栗疫病菌分生孢子的形成。实验证明，Pro1基因被潮霉素抗性基因hph置换后得到的缺失突变体产孢量减少，对高盐和渗透压敏感，在离体板栗树枝上能够形成与野生型大小没有显著差异的致病斑。本专利技术对产孢相关基因Pro1的功能研究，对研究板栗疫病菌及相关丝状真菌分生孢子形成的分子机制和对外界环境的响应机制具有重要的理论意义，而且对于研发控制板栗疫病及其它植物病害的候选药物具有重要意义。【专利说明】板栗疫病菌产孢基因Prol及其应用
本专利技术属于微生物基因工程和植物保护领域，尤其涉及一种影响真菌分生孢子形成的板栗疫病菌产孢基因Prol及其应用。
技术介绍
板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)是引起板栗疫病的病原菌,在分类上属于子囊菌中的丝状真菌，现在已成为研究植物病原真菌致病机理的ー个模式菌。板栗疫病菌可进行有性生殖和无性生殖，在有性世代产生球形或扁球形、有长颈的子囊壳，子囊产生在子囊壳内，子囊孢子内生于子囊中；在无性世代，板栗疫病菌形成单室或多室、大小不均、形状不规则的分生孢子器，内聚集着直或略弯的长椭圆或圆柱形、无色、单倍体的分生孢子。分生孢子器和子囊壳均内生于子座内。在病害循环中，有性生殖的子囊孢子主要作为菌株变异(新的无性亲和群 )的来源，而无性生殖的分生孢子则主要是植物生长季节中病菌和病害扩散的来源。因此，阐明分生孢子形成和调控的分子机制，对于筛选植物病原真菌的分子靶标，进而研发控制真菌病害的特异性药物，具有重要的应用意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种板栗疫病菌产孢基因Prol及其应用，该基因在板栗疫病菌的分生孢子形成和外界因子响应起重要作用，对筛选植物病害防治的候选靶标药物具有重要意义。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案:板栗疫病菌产孢基因Prol，具有序列表SEQ.1D.N0.1的碱基序列，由1641个碱基组成，4个外显子，分别位于SEQ.1D.N0.1的5'端第I位至40位碱基之间、第99位至397位碱基之间、第487位至751位碱基之间和第2836位至3641位碱基之间；或者具有编码序列表SEQ.1D.N0.3氨基酸序列的碱基序列。与上述板栗疫病菌产孢基因Prol具有80%以上同源性且编码相同功能蛋白质的碱基序列。板栗疫病菌产孢基因Prol或其缺失、突变或修饰后的基因在控制板栗疫病菌分生孢子产量或对外界因子响应能力中的应用。板栗疫病菌产孢基因Prol的编码区序列构建的表达载体或基因敲除盒。上述表达载体或基因敲除盒转化获得的细胞系或宿主菌。以上述板栗疫病菌产孢基因Prol中任一区域碱基序列设计的引物。上述引物通过PCR扩增用于检测在化合物处理状况下Prol基因的表达。板栗疫病菌产孢基因Prol的cDNA，具有序列表SEQ.1D.N0.2的碱基序列，由1416个碱基组成；或者具有编码序列表SEQ.1D.N0.3氨基酸序列的碱基序列。板栗疫病菌产孢基因Prol编码的蛋白质或其同源蛋白，具有序列表SEQ.1D.N0.3,由472个氨基酸组成；或SEQ.1D.N0.4 (稻痕菌(Manapothia oryzae)同源蛋白，一致性 67%)、SEQ.1D.N0.5 (尖孢铼刀菌(Fusarium oxysporum)同源蛋白，一致性 63%)的氨基酸序列。上述蛋白质或其同源蛋白为靶标在设计和筛选抗真菌药物中的应用。以上述蛋白质或与其有40%以上一致性的同源蛋白中任一区域氨基酸序列设计的多肽。上述多肽制备抗体用于检测在化合物处理状况下Prol蛋白的表达。本专利技术所提供的板栗疫病菌编码gamma-谷氨酰激酶(Y-glutamyl kinase)蛋白，名称为 Prol,是5_羧基-A し批咯啉合酶(A LpyrroIine-5-carboxylate synthetase)上游成员，来源于板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica) EP155菌株(ATCC38755)。将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的Prol蛋白的氨基酸序列在板栗疫病菌基因组网站(http://genome, jg1-psf.0rg/pages/blast.jsf?db=Crypa2ノ进打 blastp 分析，犾得与Prol同源蛋白，ID号为335454』值为9.4OE-116。Prol蛋白的功能与酿酒酵母抗冷和抗渗透压カ有关，但是在其它真菌中的功能还未有报道。本专利技术通过对Prol与其它植物病原真菌中同源蛋白的聚类分析了该蛋白进化的保守性和亲缘关系(图1)，与稻瘟菌和粗脉胞菌亲缘关系最近，同源性分别为67.3%和67.8% ;与尖孢铼刀菌亲缘关系较远，与产黄青霉的亲缘关系最远，同源性分别为63.1%和59.1%，可见Prol蛋白在丝状真菌中进化较保守，在致病真菌中执行ー些基本的功能。为了研究Prol在板栗疫病菌中的功能，专利技术人通过同源重组方法以高效同源重组系统AkuSO为出发菌株构建了 Prol的缺失突变体AProl并进行了功能互补(图2)，构建的突变体PCR验证基因Prol已被潮霉素抗性基因置換，且检测不到Prol的转录产物，而重新导入Prol基因的互补株内检测到Prol基因转录产物。将突变体AProl接种到PDA平板培养观察表型，该菌株表型与EP155和A ku80无显著不同，色素减少(图3);将突变体AProl接种到分别添加了 IM Sorbitol和0.2M NaCl的PDA平板培养，发现该菌株在高渗透压力下和高盐压力下生长均显著慢于EP155和Aku80 (图3)，证明了 Prol基因的缺失导致板栗疫病菌对高盐和高渗透压敏感；将突变体AProl接种到板栗树枝进行致病力检测，AProl产生的致病斑大小与EP155和Aku80的致病斑大小无显著差异(图3)，可见基因Prol不是板栗疫病菌致病カ相关基因。突变体AProl的产孢量(1.16X106±4.17X IO5个/mL)只有EP155 (2.08X 107±3.38X 106 f/mL)#P A ku80 (1.79 X 107± 1.63 X IO6 个/mL)的 5.6%和6.5%，证明了 Prol基因的缺失导致板栗疫病菌的分生孢子产量显著減少(图4)。综合以上结果，说明Prol基因是板栗疫病菌分生孢子形成机制和对外界因子响应机制所必需的基因。因此，筛选能够阻止该基因表达与其蛋白质的表达、修饰与定位的化合物，可以有效控制板栗疫病菌的分生孢子的产生和对外界环境的响应，可以作为新型杀菌剂的候选新药物直接利用。也就是说，本专利技术所提供的Prol的ー个重要用途是，该基因的表达与其蛋白质的表达、修饰与定位可以作为重要候选靶位点用于抗真菌药剂(特别是抗板栗疫病菌的药剂)的筛选和设计中。进ー步解析该基因參与的分生孢子形成机制和对外界因子响应机制，从中也可以发现候选靶位点用于抗真菌药剂(特别是抗板栗疫病菌药剂)的筛选和设计中。此外，也可以以该基因核苷酸序列的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种板栗疫病菌产孢基因Pro1，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列，或者具有编码序列表SEQ.ID.No.3氨基酸序列的碱基序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈保善，姚姿婷，邹承武，周辉，王金子，卢立丹，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：