一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法及试剂盒。涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术，提供一种快速、灵敏、特异的结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法及试剂盒。提取结核分枝杆菌样本的DNA；根据结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药决定区，设计引物和探针；构建单管单色实时PCR体系，进行结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的PCR检测，比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线熔点的差异，判断样品是否发生突变。样品的熔点与阳性对照的熔点一致时判定为野生型，试验菌株对氟喹诺酮敏感；样品的熔点低于阳性对照至少2℃时判定为突变型，试验菌株对氟喹诺酮耐药。提高结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变检测灵敏度、特异性，缩短检测所需时间。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及结核分枝杆菌耐药突变的检测技术，特别涉及一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线分析技术用于检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变。
技术介绍
20世纪80年代以来，结核病疫情重新上升，成为与艾滋病并列的全球性危害最严重的传染病。据世界卫生组织统计，目前全球三分之一的人口感染结核分枝杆菌，每年新增 800万病人，死亡200 300万人，是目前死亡率最高的传染性疾病。根据世界卫生组织的评估，我国是世界上22个结核病高负担国家之一，患者人数仅次于印度，居全球第二位。今年召开的第二届全球遏制结核病伙伴论坛大会上，将我国列在需要特别引起警示的国家和地区的第一位。喹诺酮类药物是一类人工化学合成抗菌药，由于该类药物均具有4-喹诺酮母核的基本结构，故由此命名。氟诺喹酮类在喹诺酮母核的第六6位上引入氟，第7位上引入哌嗪基或吡咯啉基的衍生物，为第3代喹诺酮产品。已用于临床抗分枝杆菌的氟喹诺酮类药物有环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)，氧氟沙星(Ofloxacin，0FL)，左氧氟沙星 (Levof loxacin，LEV)，斯帕沙星(Sparf loxacin，SPX)，加替沙星(Gatif loxacin，GAT)，莫西沙星(Moxifloxacin，Μ0Χ)等。随着喹诺酮类抗菌药物在结核分枝杆菌(MTB)感染中使用的增多，结核分枝杆菌对该类抗菌药物的耐药率逐渐上升。因此，对氟喹诺酮耐药突变的检测已成为必要。目前，临床上采用的耐药检测方法可分为表型检测和基因检测两类，并以表型检测为主。表型检测中的常规药敏试验方法、BACTEC TB-460液体培养基药敏试验方法以及噬菌体生物扩增法已应用于临床，然而这些方法都有明显的局限性。常规药敏试验方法受结核杆菌生长缓慢影响，需要6 8周甚至更长时间才能得到结果。BACTEC TB-460液体培养基药敏试验方法虽较灵敏，速度较快，但需昂贵设备，且易受杂菌污染，并有放射性危害。噬菌体生物扩增法则受干扰因素多，且操作复杂。由于目前的表型检测难以形成高效准确的检测手段，常常造成病情延误，更难以实现追踪治疗。已有的基因型检测方法 W DNA IlJ^5 (1、Dauendorffer, JN, Guillemin I， Aubry A et al, Identification of mycobacterial species by PCR sequencing of quinolone resistance-determining regions of DNA gyrAse genes. J Clin Microbiol. 2003,41 :1311-1315.)，线性杂交法 (2、Giannoni F, Iona Ε, Sementilli F et al. Evaluation of a new line probe assay for rapid identification of gyrA mutations in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 2005,49 :2928-2933.), PCR-SSCP Tj 法(3、 Cheng AF, Yew WW, Chan Eff et al.Multiplex PCR amplimer conformation analysis for rapid detection of gyrA mutations in fluoroquinolone-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. Antimicrob Agents Chemother. 2004,48 :596-601), DHPLC 方法(4、Shi R, Otomo K, Yamada H et al. Temperature-mediated heteroduplexanalysis for the detection of drug-resistant gene mutations in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by denaturing HPLC, SURVEYOR nuclease. Microbes Infect. 2006，8 :128-135)，生物芯片法(5、Antonova 0V, Gryadunov DA, Lapa SA et al. Detection of mutations in Mycobacterium tuberculosis genome determining resistance to fluoroquinolones by hybridization on biological microchips. Bull Exp Biol Med. 2008，145 :108-113)，实时 PCR 方法(6、van Doorn H R，An DD, de Jong MD et al. Fluoroquinolone resistance detection in Mycobacterium tuberculosis with locked nucleic acid probe real-time PCR. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2008,12 :736-742) 等，德国HAIN公司已有可检测gyrA基因突变的GenoType MTBDRs 1试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种快速、灵敏、特异的结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法，即一种基于双标记自淬灭探针的探针熔解曲线分析技术。本专利技术的另一目的在于提供一种快速、灵敏、特异的结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法的试剂盒。所述结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法包括以下步骤1)提取结核分枝杆菌样本的DNA ；2)根据结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药决定区OiRDR)，利用引物设计软件ft~imer 5 设计引物和探针；在步骤2、中，所述设计引物和探针的具体方法如下a，引物设计在所检测的突变两端，探针覆盖突变位点；b，探针的荧光基团可选择FAM、R0X,HEX, CY5、ΤΕΤ、CAL-Fluor等中的任意一种，淬灭基团可选择BHQ或Dabcyl等，探针可以进行各种类型的修饰(如LNA标记)等。所述引物和探针的具体序列为Primer-F 5' -CCAAGTCGGCCCGGTCGGTTG-3，Primer-R 5’ -GACCAGGGCTGGGCCATG-3’Probe-A 5‘ -FAM-GGCGACGCGTCGATCTACGACCGCC-BHQ-3‘3)构建单管单色实时PCR体系，进行结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的PCR检测， 比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点0 值)的差异，判断样品是否发生突变， 样品的熔点与阳性对照的熔点一致(误差不超过rc)时判定为野生型，试验菌株对氟喹诺酮敏感；样品的熔点低于阳性对照至少2°C时判定为突变型，试验菌株对氟喹诺酮耐药。在步骤3)中，所述单管单色实时本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的检测方法，其特征在于包括以下步骤：１）提取结核分枝杆菌样本的ＤＮＡ；２）根据结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药决定区，利用引物设计软件Ｐｒｉｍｅｒ ５设计引物和探针；３）构建单管单色实时ＰＣＲ体系，进行结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的ＰＣＲ检测，比较所检测样品与阳性对照之间熔解曲线的熔点的差异，判断样品是否发生突变。样品的熔点与阳性对照的熔点一致时判定为野生型，试验菌株对氟喹诺酮敏感；样品的熔点低于阳性对照２℃或２℃以上时判定为突变型，试验菌株对氟喹诺酮耐药。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李庆阁，刘歆，张轶，胡思玉，
申请(专利权)人：厦门大学，厦门致善生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：92
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