本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种鉴定大豆疫霉无毒基因PsAvr1k的特异性分子标记引物及方法，该特异性分子标记引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。通过该分子标记进行PCR扩增可以快速、高效检测田间大豆疫霉菌株是PsAvr1k毒性菌株还是无毒菌株。本研究不仅可以用于研究PsAvr1k无毒基因在田间的分布情况，还能够揭示大豆疫霉菌PsAvr1k在田间的致病型分化变异特点，而且为制定抗性品种选用策略提供依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，公开了一种鉴定大豆疫霉无毒基因PsAvr1k的特异性分子标记引物及方法，本专利技术通过特异性分子标记的方法能够在大豆疫霉中快速有效检测大豆疫霉无毒基因PsAvr1k。
技术介绍
大豆疫霉菌引起的大豆根腐病是世界范围内大豆生产上的一种毁灭性病害,大豆疫霉隶属于卵菌，该类病原菌虽然在形态上与真菌相似，但在进化上却和硅藻及蓝藻关系较近，为茸鞭生物界，因此一般真菌杀菌剂往往对大豆疫霉和其它卵菌无效。植物抗病品种的应用，由于克服了药害以及环境污染等问题，成为农业生产上实现抗病的重要手段。但是自然界中由病原菌效应子介导的病原菌快速进化使得抗病品种很快就会被新病原菌克服，因此抗病品种的应用也面临着一定的挑战。了解自然界中大豆疫霉无毒基因在不同菌株中的分布情况，为农业生产上制定正确的抗病品种应用策略提供依据。植物与病原菌的长期协同进化过程中，病原菌为了成功侵染植物，会分泌大量效应子作用于植物的不同细胞部位来干扰植物的免疫反应。植物为了抑制病原菌的侵染进化出抗病蛋白来识别这些效应子，触发植物的免疫反应，这类效应子又被称为无毒基因。大豆疫霉分泌的无毒基因与抗病基因的识别直接决定着卵菌病害的发生。而无毒基因在进化过程中又通过碱基突变，氨基酸缺失，碱基插入导致移码突变等策略，来逃避寄主抗病蛋白的识别。因此了解毒性菌株和无毒菌株中无毒基因的序列特点对于了解无毒基因的毒力变化、了解无毒基因在田间的分布规律、制定抗病品种使用策略具有重要的意义。本专利基于分子标记的策略，设计针对无毒菌株的特异性引物标记，为检测田间大豆疫霉菌株对于相应的抗病品种为毒性菌株还是无毒菌株提供有效手段。
技术实现思路
为了解决农业生产中制定抗病品种选育策略的难题，本专利技术的目的在于提供一种检测大豆疫霉菌株中无毒基因PsAvr1k的特异性分子标记引物、试剂盒及其应用。本专利技术的另一目的在于提供一种快速、简便鉴定大豆疫霉无毒基因PsAvr1k的方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种用于扩增大豆疫霉不同菌株中PsAvr1k全长序列的引物对，上游引物核苷酸序列如
SEQ ID No.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。一种检测大豆疫霉菌株中无毒基因PsAvr1k的特异性分子标记引物对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。一种用于检测大豆疫霉菌株中无毒基因PsAvr1k特异性分子标记的试剂盒，包含如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物对。一种用于扩增大豆疫霉不同菌株中PsAvr1k全长序列的试剂盒，包含如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对。如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对或包含该引物对的试剂盒在扩增待测大豆疫霉菌株PsAvr1k全长序列中的应用。如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物对或包含该引物对的试剂盒在在检测大豆疫霉菌株中无毒基因PsAvr1k特异性分子标记或检测大豆疫霉菌株毒性中的应用。一种检测大豆疫霉菌株毒性的方法，以大豆疫霉菌株基因组DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物进行PCR扩增获得PsAvr1k全长序列，以所述PsAvr1k全长序列为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物进行PCR扩增，如果能够扩增出504bp的片段，则表明该大豆疫霉菌株为PsAvr1k无毒菌株，如果不能够扩增出504bp的片段，则表明该大豆疫霉菌株为PsAvr1k毒性菌株。本专利技术的技术方案具体是通过分子标记鉴定大豆疫霉菌株中无毒基因PsAvr1k的序列及其多态性，其上游引物为FL-F(SEQ ID No.1)，下游引物为FL-R(SEQ ID No.2)。根据大豆疫霉菌株无毒菌株和毒性菌株中PsAvr1k的序列的差异，设计无毒菌株特异的引物标记(STS)，上游引物为SF-F(SEQ ID No.3)，下游引物为SF-R(SEQ ID No.4)。如果该特异引物能够扩增出504bp的片段即为无毒菌株，如果不能扩增出504bp的片段，则为毒性菌株。本专利技术利用所述引物鉴定大豆疫霉无毒基因PsAvr1k的方法，具体包括以下步骤：(1)提取不同菌株大豆疫霉基因组DNA；(2)以大豆疫霉基因组DNA为模板，用所述的引物FL-F/R(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)进行PCR扩增；(3)回收扩增片段，用所述特异性引物SF-F/R(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)进行PCR扩增；若得到大小为504bp的片段，则表明所述大豆疫霉是无毒菌株，若无法得到504bp的片段，则表明所述大豆疫霉为毒性菌株。本专利技术优点和积极效果表现在：利用本专利技术所述的引物以及方法能够快速、简便、精确鉴定大豆疫霉菌株是毒性菌株
还是无毒菌株。本专利技术人前期的研究表明PsAvr1k是与大豆抗病基因Rps1k对应的无毒基因，含有PsAvr1k无毒基因的大豆疫霉无毒菌株能够触发含有Rps1k的大豆品种所介导的抗性。本专利技术不仅可以研究该无毒基因在自然群体中的分布情况，揭示大豆疫霉菌在田间发生致病型分化变异的特点，为我们在农业生产上通过监测无毒基因的分布以及变化来制定抗病策略、控制病害提供有力指导。附图说明图1大豆疫霉不同小种中扩增PsAvr1k全长基因图2大豆疫霉无毒菌株和毒性菌株中PsAvr1k全长序列比对图3大豆疫霉菌株中扩增PsAvr1k无毒菌株特异的PsAvr1k片段具体实施方式实施例1大豆疫霉不同菌株中PsAvr1k序列多态性检测1.供试菌株大豆疫霉不同毒力菌株由Brett M.Tyler教授(美国Virginia生物信息研究室)馈赠，该菌株是本领域技术人员所公知的，由南京农业大学植病系植物与疫霉互作实验室保存。菌株保存于10％V8固体培养基，保存温度为10℃。2.供试大豆幼苗的准备鉴别寄主大豆播种于装有蛭石(2-4mm)的塑料花盆(d＝10cm)里，每盆种15粒种子，放到14h光照(强光照射)/10h黑暗的温室中生长，7天后两片真叶长出后留10颗苗用于接种。所用鉴别寄主为Williams82。感病品种为Williams。3.大豆疫霉菌株致病型测定本研究采用下胚轴创伤接种法测定大豆疫霉菌株对鉴别寄主的毒性。大豆疫霉菌株在V8平板上生长3天后，用手术刀在菌落边缘挑取1cm长的菌丝体；用手术刀在大豆下胚轴(子叶下大约1cm处)向下划约0.5cm的伤口，然后将菌丝体接种到该伤口中。接种后的大豆放到14h光照(强光照射)/10h黑暗的温室中生长，2d后统计发病情况。以植株死亡率作为抗感分类标准，植株死亡率≤30％，记为抗病(A)；植株死亡率≥70％，记为感病(V)；植株死亡率在30％-70％之间，记为中间类型(M)。试验重复3次。4.大豆疫霉基因组提取本研究采用CTAB法提取大豆疫霉基因组DNA，具体操作如下：(1)取大约50mg冷冻干燥的菌丝粉于1.5ml EP管中，加入900μL CTAB(十六烷
基三甲基溴化铵)提取液(2％CTAB(w/v，g/ml)；100mM Tris HCl,pH＝8.0；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于扩增大豆疫霉不同菌株中PsAvr1k全长序列的引物对，其特征在于：上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于扩增大豆疫霉不同菌株中PsAvr1k全长序列的引物对，其特征在于：上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。2.一种用于检测大豆疫霉菌株中无毒基因PsAvr1k的特异性分子标记引物对，其特征在于：上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。3.一种检测大豆疫霉菌株中无毒基因PsAvr1k特异性分子标记的试剂盒，其特征在于：包含权利要求2所述的引物对。4.一种用于扩增大豆疫霉不同菌株中PsAvr1k全长序列的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的引物对。5.权利要求1所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：窦道龙，宋天巧，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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