本发明专利技术公开了一种可应用于干细胞和基因治疗的改造细胞的基因技术，其中，该技术的具体如下：(1)干细胞在培养基中培养，干细胞生长因子激活。(2)慢病毒载体对干细胞的基因转导和修饰。(3)重组慢病毒载体在雷帕霉素的作用下对干细胞的基因转导和重组。(4)转导后的干细胞在动物体内的实验或者体外细胞性能检测和基因重组检测。本发明专利技术具有显著提高慢病毒对细胞基因的转导和基因修饰的作用。经改造的干细胞同时又能保持干细胞的多元性和重组基因的稳定性和安全性。动物体内实验和体外细胞性能检测该发明专利技术的干细胞在体内具有良好的移植和重建的性能。本发明专利技术的另一目的是，所提供的基因改造的干细胞在临床上可用以基因治疗艾滋病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学分子生物学，基因治疗
，特别涉及一种能够应用于干细胞的基因转导、基因修饰、基因重组进行干细胞基因治疗应用的基因技术。
技术介绍
由于慢病毒的非特异靶向性，能够转导多种不同性能的细胞，包括非分裂(non-dividing)细胞。慢病毒载体已被广泛应用于基因治疗和基因修改细胞中，利用慢病毒载体对人体造血干细胞Hematopoetic stem and progenitor Cells(HSPC)进行基因转导和修饰并用于干细胞的基因治疗，包括肾上腺脑白质失养症(Cartier N,H.Science,2009；326:818-823)和地中海贫血(Cavazzana-Calvo M.Nature,2010；467:318-322)已有报道，近年来通过慢病毒转入外源基因，基因重组干细胞用以基因治疗也越来越多地进入临床。然而，现有的慢病毒引导外源基因对干细胞的基因重组率还较低。尽管在某些条件下显示出较高的转导率，转入的基因却难以对干细胞进行有效的基因修饰。外源基因在干细胞内显示出不稳定性，难以有效地整合到干细胞的基因组。另外，目前干细胞在基因治疗上的应用所受到的限制因数之一是技术上难以扩大化，难以生产大量的可用于临床上的基因修饰后的干细胞。有些在临床试验人体内所能检测到的外源基因率只有0.1％-0.3％，疗效亦未能达到满意的结果。因此，如何提高慢病毒对干细胞的基因重组率，同时又保持干细胞的多元性，保持干细胞在体内的移植成活率，以及转入的外源基因在细胞内的稳定性和如何生产大量的足够用以临床的基因重组的干细胞，并且达到临床应用的有效性，都一直是干细胞基因治疗领域的难题和挑战。
技术实现思路
鉴于上述问题，本专利技术的目的之一在于提供一种提高慢病毒对干细胞基因转导和基因修饰率，同时又能保持干细胞的多元性和重组基因的稳定性和安全性，及提高在体内的移植成活率的应用于细胞治疗，基因治疗的改造干细胞的基因技术：一种可应用于干细胞和基因治疗的改造细胞的基因技术，其中，具体应用如下：(1)干细胞在培养基中培养，干细胞生长因子激活；(2)慢病毒载体对干细胞的基因转导和修饰；(3)重组慢病毒载体在雷帕霉素(rapamycin)的作用下进行干细胞的基因转导和重组；(4)转导后的干细胞进行动物体内实验或者体外细胞性能检测和基因重组检测。在一些实施方式中，细胞可为干细胞，免疫细胞，或者不同类型的哺乳动物细胞。干细胞可采用新鲜优选或冻存复苏的干细胞。所述干细胞是造血干细胞或间充质干细胞，所述造血干细胞来源于成人运动型外周血造血CD34+干细胞，骨髓干细胞或脐带血干细胞，所述间充质干细胞来源不同组织如骨髓，皮肤，脂肪，胎盘，脐带，脐带血等；所述的培养基是含有干细胞生长因子例如SCF(recombinant human stem cell factor),Flt-3L(FMS-like tyrosine kinase-3 ligand),thrombopoietin(TPO)的培养基。在一些实施方式中，慢病毒载体可以是含有不同启动子promoter或者不同抗病基因分子therapuetic molecules结构的重组慢病毒载体。在一些实施方式中，重组慢病毒载体为自身失活的基于HIV的慢病毒载体(self-inactivating HIV-based Lentiviral vectors)。在一些实施方式中，慢病毒载体可以是携带不同抗病基因分子的重组慢病毒载体，例如携带抗艾滋病的抗病基因分子therapuetic molecules和EGFP报告基因。在一些实施方式中，基因转导的干细胞功能性检测应用humanized mouse model动物模型。另外，由于雷帕霉素具有免疫抑制，调节细胞周期，调节自噬的功能，在临床上，雷帕霉素已用来防止器官移植免疫排斥和GVHD，以及抗肿瘤试 剂。同时，雷帕霉素能够增强干细胞在免疫缺陷小鼠(immunodeficient mice)体内的移植和重建。结合雷帕霉素作用于干细胞的基因重组有可能增强干细胞基因治疗的临床应用，因此，本专利技术的另一目的在于开发雷帕霉素(Rapamycin)在细胞基因转导，修饰，重组，以及临床应用的新用途。一种利用雷帕霉素(Rapamycin)和慢病毒载体对细胞进行基因转导、修饰，和重组，应用于基因治疗的改造细胞的基因技术，其中，具体应用如下：，以在干细胞上的应用为例，(1)将干细胞在培养基中培养，之后干细胞生长因子激活；(2)应用雷帕霉素和慢病毒载体，在雷帕霉素作用下，利用慢病毒载体对干细胞进行基因转导；(3)经过转导后的干细胞在动物体内实验或者用于动物体外细胞性能检测和基因重组检测。同时，所采用的慢病毒载体携带抗艾滋病的基因分子，因此本专利技术所提供的干细胞可临床上用以基因治疗艾滋病。在一些实施方式中，细胞可为干细胞，免疫细胞，或者不同类型的哺乳动物细胞；所述干细胞是造血干细胞或间充质干细胞，所述造血干细胞来源于成人运动型外周血造血CD34+干细胞，骨髓干细胞或脐带血干细胞，所述间充质干细胞来源不同组织如骨髓，皮肤，脂肪，胎盘，脐带，脐带血等；所述的培养基是含有干细胞生长因子其中包括SCF(recombinant human stem cell factor),Flt-3L(FMS-like tyrosine kinase-3 ligand),thrombopoietin(TPO)的培养基。在一些实施方式中，雷帕霉素结合病毒载体对细胞进行基因重组应用于基因治疗。在一些实施方式中，慢病毒载体可以是含有不同启动子promoter或者不同抗病基因分子therapuetic molecles结构的重组慢病毒载体。在一些实施方式中，重组慢病毒载体为自身失活的基于HIV的慢病毒载体(self-inactivating HIV-based Lentiviral vectors)。在一些实施方式中，慢病毒载体携带有抗艾滋病的基因分子或携带EGFP报告基因。在一些实施方式中，慢病毒载体可以是携带不同抗病基因分子(therapuetic molecules)的重组慢病毒载体。在一些实施方式中，基因转导的干细胞功能性检测应用humanized mouse model动物模型。本专利技术的有益效果是具有提高慢病毒载体对细胞的基因重组率。具体在干细胞的应用上，提高对干细胞基因的转导和基因修饰，重组率，同时又能保持干细胞的多元性和重组基因的稳定性和安全性，及提高在体内的移植成活率的效果。由于将人体造血干细胞CD34+HSPC在培养基中培养，加入雷帕霉素和慢病毒载体，在雷帕霉素作用下，利用慢病毒载体对干细胞进行基因转导，有效地提高慢病毒载体对干细胞的基因转导。对所测试的慢病毒载体的结构没有限制，对不同个体的干细胞，对不同来源的干细胞也没有限制。更重要的是，有效地增强基因修饰和基因重组率。所转导的基因在动物模型体内以及体外实验都表现出稳定性，而且在动物体内有效地种植并能分化成不同的子细胞。上述的雷帕霉素是可以加入，也可以是不加入。在雷帕霉素的作用下，慢病毒对造血干细胞的基因转导率提高两到三倍。利用该技术转入的外源基因明显显示出其稳定性。重组后的干细胞在体外实验，动物体内实验都显示出良好的干细胞性能本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可应用于干细胞的基因技术，其特征在于，具体如下：(1)干细胞在培养基中培养，干细胞生长因子激活；(2)慢病毒载体对干细胞的基因转导和修饰；(3)转导后的干细胞在动物体内实验或者动物体外细胞性能检测和基因重组检测。
【技术特征摘要】
1.一种可应用于干细胞的基因技术，其特征在于，具体如下：(1)干细胞在培养基中培养，干细胞生长因子激活；(2)慢病毒载体对干细胞的基因转导和修饰；(3)转导后的干细胞在动物体内实验或者动物体外细胞性能检测和基因重组检测。2.根据权利要求1所述的一种可应用于干细胞的基因技术，其特征在于，所述的干细胞采用新鲜优选或冻存复苏的干细胞；所述干细胞是造血干细胞或间充质干细胞，所述造血干细胞来源于成人运动型外周血造血CD34+干细胞、骨髓干细胞或脐带血干细胞，所述间充质干细胞来源于骨髓、皮肤、脂肪、胎盘、脐带或脐带血；所述的培养基是含有干细胞生长因子的培养基。3.根据权利要求1所述的一种可应用于干细胞的基因技术，其特征在于，所述的慢病毒载体是含有不同启动子或者不同抗病基因分子结构的重组慢病毒载体。4.根据权利要求1所述的一种可应用于干细胞的基因技术，其特征在于，所述的慢病毒载体为自身失活的基于HIV的慢病毒载体或携带有抗艾滋病的基因分子的重组慢病毒载体。5.一种可应用于基因治疗的改造细胞的基因技术，其特征在于，具体如下：利用雷帕霉素和慢病毒载体对细胞进行基因转导、修饰和重组：(1)将细胞在培养基中培养，之后细胞生长因子激活；(2)应用雷帕霉素和慢病毒载体，在雷帕霉素作用下，利用慢病毒载体对细胞进行基因转导、修饰和...
【专利技术属性】
技术研发人员：李黎静，梁青龙，张琮珊，鲁晓玲，何力丰，
申请(专利权)人：何力丰，
类型：发明
国别省市：福建;35
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