本发明专利技术提供了一种维持细胞表型的肝干细胞体外高活性三维扩增方法，其包括如下步骤：（1）准备培养基，培养基成分为：1L DMEM/F12、15‑20mg/L成纤维细胞生长因子胰岛素10‑15mg/L、0.1‑0.2mg/L谷氨酸、0.5‑0.8mg/L尼克酰胺、0.1‑0.2mg/L亚硒酸、0.05‑0.1mg/Lβ‑巯基乙醇、0.1‑0.6mg/Lα肌动蛋白、0.2‑0.3mg/L醋酸钠、0.001‑0.003mg/L丙酮酸钠和占总培养基重量2‑3%的胎牛血清；（2）将灭菌后的多孔凝胶浸没于培养基中，将肝干细胞接种至多孔凝胶中，然后进行培养。本发明专利技术能获得表型稳定、活性高的干细胞，可以保持良好的干细胞特性。
【技术实现步骤摘要】
一种维持细胞表型的肝干细胞体外高活性三维扩增方法
本专利技术属于干细胞
，具体涉及一种维持细胞表型的肝干细胞体外高活性三维扩增方法。
技术介绍
随着干细胞在医疗领域日益受到重视，干细胞的扩增培养开始受到人们的关注。然而，目前的干细胞培养技术面临着干细胞分化的问题，使得干细胞的扩增获取成为技术难点。另外，在培养扩增过程中，如何维持干细胞的活性，也是技术难题之一。具体到肝（干）细胞而言，一般的培养方式难以进行维持细胞的功能，而三维培养可以部分的解决该问题。不过，现有的三维培养的条件较为苛刻，需在失重状态下才能获得较好的结果，其技术要求高，较难进行产业化推广。因此，本领域亟需一种既可以维持细胞表型，又可以维持细胞高活性的肝干细胞培养方式，以缓解高活性肝干细胞难以获取的行业技术难题。
技术实现思路
针对现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种维持细胞表型的肝干细胞体外高活性三维扩增方法，该方法包括如下步骤：（1）准备培养基，所述培养基由如下组分组成：DMEM/F12培养基1L成纤维细胞生长因子15-20mg/L胰岛素10-15mg/L谷氨酸0.1-0.2mg/L尼克酰胺0.5-0.8mg/L亚硒酸0.1-0.2mg/Lβ-巯基乙醇0.05-0.1mg/Lα肌动蛋白0.1-0.6mg/L醋酸钠0.2-0.3mg/L丙酮酸钠0.001-0.003mg/L胎牛血清占总培养基重量2-3%；（2）将灭菌后的多孔凝胶浸没于培养基中，将肝干细胞接种至多孔凝胶中，然后进行培养；所述多孔凝胶的孔径为300-800微米；所述多孔凝胶包括壳聚糖多孔凝胶或透明质酸水凝胶。优选的，所述培养基由如下组分组成：DMEM/F12培养基1L成纤维细胞生长因子15-20mg/L胰岛素12-14mg/L谷氨酸0.12-0.18mg/L尼克酰胺0.65-0.75mg/L亚硒酸0.1-0.2mg/Lβ-巯基乙醇0.05-0.1mg/Lα肌动蛋白0.2-0.4mg/L醋酸钠0.2-0.3mg/L丙酮酸钠0.001-0.003mg/L胎牛血清占总培养基重量2-3%。更优选的，所述培养基由如下组分组成：DMEM/F12培养基1L成纤维细胞生长因子18mg/L胰岛素13mg/L谷氨酸0.125mg/L尼克酰胺0.7mg/L亚硒酸0.15mg/Lβ-巯基乙醇0.08mg/Lα肌动蛋白0.3mg/L醋酸钠0.25mg/L丙酮酸钠0.002mg/L胎牛血清占总培养基重量2.5%。所述培养基和所述多孔凝胶的体积比为2-3:1。优选的，所述培养基和所述多孔凝胶的体积比为2.5:1。对于本专利技术而言，只要多孔凝胶能很好的浸没于培养基中便可，上述所设定的体积比仅仅是因为在这个比例下，凝胶可以充分的浸没于培养基中。所述肝干细胞的接种量为1×104个/ml。优选的，所述多孔凝胶的孔径为500微米。本专利技术对于多孔凝胶的孔径并没有非常严格的要求，只要有适于肝干细胞增值的空间便可。本专利技术的技术效果依赖于本专利技术的培养基。值得说明的是，本专利技术的培养基是在三维培养时才能发挥非常好的效果。所述培养是在37℃，体积分数5%CO2的条件下培养。所述多孔凝胶为壳聚糖多孔凝胶。本专利技术的有益效果：1、本专利技术的培养扩增方法简单，无需苛刻的条件，所用的培养基的成分不复杂，容易配制，价格低廉；2、本专利技术能获得表型稳定、活性高的干细胞，可以保持良好的干细胞特性。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本专利技术进行进一步的说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述
技术实现思路
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。实施例1大鼠肝干细胞系WB-F344，购于北京裕恒丰科技有限公司配制培养基，培养基由如下组分组成：DMEM/F121L成纤维细胞生长因子18mg/L胰岛素13mg/L谷氨酸0.125mg/L尼克酰胺0.7mg/L亚硒酸0.15mg/Lβ-巯基乙醇0.08mg/Lα肌动蛋白0.3mg/L醋酸钠0.25mg/L丙酮酸钠0.002mg/L胎牛血清占总培养基重量2.5%。以接种量1×104个/ml将肝干细胞接种于孔径为500微米的壳聚糖多孔凝胶中，置于上述培养基中，凝胶与培养基的体积比为2.5:1，在37℃，体积分数5%CO2的条件下培养，培养21天，培养第5天换液，之后每隔4天换液。培养过程中，检测肝干细胞的LDH含量，并利用荧光定量RT-PCR检测肝干细胞标志物mRNA的变化。LDH只有在细胞受到损伤或死亡的时候才会释放至胞外，因此，检测LDH的含量可以反映肝干细胞的活性。LDH活性（U/106细胞）=（ODu－ODc）／（ODs－ODb）×Cs×换液量／I，ODu为样本孔吸光度值，ODc为样本对照孔吸光度值，ODs为标准孔吸光度值，ODb为空白孔吸光度值，Cs为标准浓度（2mmol/l），Ｉ为初始细胞接种量。肝干细胞表达EpCAM、ALB、CK19、NCAM，不表达AFP。而肝干细胞分化时，则会出现细胞标志的变化。因此，利用荧光定量RT-PCR检测肝干细胞标志物mRNA的变化可以判断肝干细胞是否分化。设置三个对照组，对照组1为利用本专利技术培养基但在平板中培养，对照组2为除培养基为Kubota培养液之外其余与本专利技术一致，对照组3为除培养基为中国专利201310146165.5中的培养基之外其余与本专利技术一致。实验结果如下：表1培养7、14和21天后培养基上清中LDH的活性检测天数本专利技术对照组1对照组2对照组371.302±0.3605.716±0.4404.533±0.2205.115±0.450140.087±0.0121.619±1.3351.534±1.0022.334±0.945215.104±0.44211.345±1.24013.012±2.54314.012±1.141本专利技术的培养方式培养肝干细胞21天时均能表达EpCAM、ALB、CK19、HNF6、CYP3A7，不表达AFP和CYP3A4，这说明本专利技术的培养方法没有发生肝干细胞分化。对照组3中的肝干细胞已分化。另外，本专利技术肝干细胞EpCAM、ALB、CK19、HNF6、CYP3A7的表达量分别是对照组2的17倍、22倍、3倍和29倍。这说明，本专利技术非常利于肝干细胞表型的维持。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种维持细胞表型的肝干细胞体外高活性三维扩增方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）准备培养基，所述培养基由如下组分组成：DMEM/F12培养基 1L成纤维细胞生长因子 15‑20 mg/L胰岛素 10‑15mg/L谷氨酸 0.1‑0.2mg/L尼克酰胺 0.5‑0.8mg/L亚硒酸 0.1‑0.2mg/Lβ‑巯基乙醇 0.05‑0.1 mg/Lα肌动蛋白 0.1‑0.6mg/L醋酸钠 0.2‑0.3mg/L丙酮酸钠 0.001‑0.003mg/L胎牛血清 占总培养基重量2‑3%；将灭菌后的多孔凝胶浸没于培养基中，将肝干细胞接种至多孔凝胶中，然后进行培养；所述多孔凝胶的孔径为300‑800微米；所述多孔凝胶包括壳聚糖多孔凝胶或透明质酸水凝胶。
【技术特征摘要】
1.一种维持细胞表型的肝干细胞体外高活性三维扩增方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）准备培养基，所述培养基由如下组分组成：DMEM/F12培养基1L成纤维细胞生长因子15-20mg/L胰岛素10-15mg/L谷氨酸0.1-0.2mg/L尼克酰胺0.5-0.8mg/L亚硒酸0.1-0.2mg/Lβ-巯基乙醇0.05-0.1mg/Lα肌动蛋白0.1-0.6mg/L醋酸钠0.2-0.3mg/L丙酮酸钠0.001-0.003mg/L胎牛血清占总培养基重量2-3%；将灭菌后的多孔凝胶浸没于培养基中，将肝干细胞接种至多孔凝胶中，然后进行培养；所述多孔凝胶的孔径为300-800微米；所述多孔凝胶包括壳聚糖多孔凝胶或透明质酸水凝胶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基由如下组分组成：DMEM/F12培养基1L成纤维细胞生长因子15-20mg/L胰岛素12-14mg/L谷氨酸0.12-0.18mg/L尼克酰胺0.65-0.75mg/L亚硒酸0.1-0.2mg/Lβ-巯基乙醇0.05-0.1mg/Lα肌动蛋白0.2-0.4mg/...
【专利技术属性】
技术研发人员：向红先，
申请(专利权)人：成都育芽科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51
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