一种皮肤干细胞活性成分的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种皮肤干细胞活性成分的提取方法，是将人源性皮肤组织加入添加有PMSF蛋白酶抑制剂的Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的生理盐水混合消化液中恒温摇床培养，以含体积分数10%胎牛血清的M199培养基终止消化，离心收集沉淀，生理盐水重悬细胞得到复合皮肤干细胞，应用磁珠标记的Dlk抗体和Sca1抗体筛选出Dlk1+/Sca1−皮肤干细胞。以本发明专利技术方法提取的Dlk1+/Sca1−皮肤干细胞纯度可以达到95.8%，皮肤干细胞数量多、细胞存活率高、活性好，应用于治疗脱发的药物中，生发效果显著。

Method for extracting active component of skin stem cell

The invention discloses a method for extracting the active ingredients of a skin stem cell, is the human skin tissue culture adding thermostatic shaker saline mixed type I collagenase and collagenase type PMSF protease inhibitor in the volume fraction of 10% fetal bovine serum M199 medium terminated digestion, centrifugal collection precipitation, physiological saline cell composite skin stem cells, Dlk1+/Sca1 cells and skin stem screening Dlk antibody and Sca1 antibody labeled beads. The extraction method of the invention of Dlk1+/Sca1 - skin stem cell purity can reach 95.8%, skin stem cell number and cell survival rate, good activity, used in medicine for treating alopecia, hair effect.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种皮肤干细胞活性成分的提取方法。以本专利技术方法提取的皮肤干细胞活性成分可应用于治疗脱发。
技术介绍
脱发是皮肤科的常见多发病，多发于男性，严重影响人的外观和心理状态。脱发分为多种类型，雄激素源是最常见的一种。中国脱发患病率约30.29%，其中25岁至55岁男性中25%有雄激素源性脱发。而西方男性脱发现象更明显，30岁到70岁男性脱发率与年龄成正相关。随着社会压力的增加，男性心理负担增大，脱发向低龄化发展，患病率也成逐年上升趋势。众多学者致力于脱发治疗研究，但不论是中医的药物、针灸或穴位按摩治疗，或西医的药物或手术移植治疗，还是中西医结合治疗，虽然能在短期使毛发再生，但复发率高，副作用大。目前美国食品药品管理局(FDA)批准米诺地尔和非那雄胺两种治疗脱发的药物用于治疗斑秃和雄激素性脱发，对大多数患者有较好的生发效果。随后法国和英国等欧洲国家也开始上市销售，我国也有米诺地尔制剂用于临床。但米诺地尔液会引起刺激性或变应性接触性过敏反应，部分患者可出现瘙痒和头皮脱屑症状；使用过程中还可能引起面部和四肢多毛症；严重的会造成心跳加快、血压升高等副作用；停用后治疗效果逐渐消失。非那雄胺仅适用于男性脱发治疗，但长期临床实践表明，其存在引起性功能异常、精子一过性减少和男性乳房发育异常等不良反应，尚有其它包括骚痒感、风疹及面唇部肿胀等过敏反应和睾丸疼痛等不良反应。干细胞(StemCell)是一类具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能的细胞群体，是形成人体各种组织、器官的“万能细胞”、“祖宗细胞”。干细胞可以产生和分泌大量的生物活性因子如干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、基质细胞源性生长因子(SDF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素-6与白介素-7(IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等，这些干细胞生物活性因子具有促进细胞增殖、分化、抗凋亡等功能，可有效活化人体干细胞、调控机体细胞信号传导，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老细胞。干细胞还可以产生天然免疫蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等，抵御或修复自身和外界因素对机体细胞造成的损伤。利用干细胞分泌产生的生物活性因子激活机体干细胞，进而通过自身干细胞生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老细胞，从而治疗脱发的问题，在疾病防治与保健美容领域具有广阔的应用前景。可以通过很多种方式获取干细胞分泌的活性成分。CN104622904A公开了一种皮肤干细胞活性成分及其应用，是先以胶原酶III与含双抗的DMEM的混合酶液对皮肤组织进行首次消化，再用0.25wt%胰酶/EDTA在37℃二次消化，收集两次消化后通过200目滤网的滤液，以磁珠筛选法筛选出Dlk1+/Sca1−皮肤干细胞。以该方法提取的皮肤干细胞数量少，且胶原酶III与胰酶的消化时间长，对细胞损伤较大，导致提取的皮肤干细胞成活率低、活性较差，最终影响其治疗脱发的药效。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种皮肤干细胞活性成分的提取方法，以本专利技术方法提取皮肤干细胞活性成分，能够提高皮肤干细胞的数量、成活率及活性，促进毛发再生。本专利技术所述的皮肤干细胞活性成分的提取方法是用生理盐水将人源性皮肤组织清洗干净，机械破碎，加入添加有PMSF蛋白酶抑制剂的Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的生理盐水混合消化液中，37℃恒温摇床培养，以含体积分数10%胎牛血清的M199培养基终止消化，收集消化液，离心收集沉淀，以生理盐水重悬细胞，重复2～3次，得到复合皮肤干细胞；应用磁珠标记的Dlk抗体和Sca1抗体，以磁珠筛选法从复合皮肤干细胞中筛选出Dlk1+/Sca1−皮肤干细胞。其中，所述的混合消化液是配制总质量浓度为0.25%的Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的生理盐水溶液，加入溶液质量1%的PMSF蛋白酶抑制剂，调节溶液的pH值为7.2～7.4得到的混合消化液。进一步地，所述混合消化液中，Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的质量比为1∶1。胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。本专利技术选用Ⅰ型和Ⅱ型胶原酶混合，能够温和地消化细胞间质，但对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。同时，该混合胶原酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在，仍然具有活性，可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率。本专利技术添加的PMSF蛋白酶抑制剂能够缓解消化液对组织的消化作用，使消化更加缓和，减小对干细胞的损伤，在生理pH和温度条件下，特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶的化学本质是一种蛋白质，对温度、pH和导致蛋白质变性的各种因素均非常敏感，极易受到外界条件影响而改变本身的构象和性质。本专利技术调整消化液的pH值在7.2～7.4并在37℃消化，接近人的生理pH值和温度，能够更好的发挥胶原酶的消化作用，减少消化时间，减轻组织因消化时间过久引发的对干细胞的损伤。本专利技术上述提取方法中，具体是将所述混合消化液置于摇床上，以100～200r/min的转速培养30～50min。经流式细胞仪检测，采用本专利技术上述方法提取的Dlk1+/Sca1−皮肤干细胞的纯度可以达到95.8%。台盼蓝染色比较发现，Dlk1+/Sca1−皮肤干细胞的细胞存活率也明显高于以CN104622904A方法提取获取的细胞。本专利技术同时也提供了上述获得的皮肤干细胞活性成分的培养方法，是将分选获取的Dlk1+/Sca1−皮肤干细胞接种于培养瓶中，加入表皮干细胞专用培养基，在饱和湿度、体积分数5%CO2、37℃环境下恒温培养，待细胞长到80%～90%融合后，用不含EDTA的0.25wt%胰酶消化传代；将传代细胞移入新的培养瓶中，重复以上培养、增殖过程。在细胞生长最佳期收集细胞上清液，1000r/min离心5min，将弃去细胞沉淀后的上清继续以9000r/min离心15min，弃去液体，用生理盐水重悬沉淀物，最终得到皮肤干细胞活性成分。收集到的含有皮肤干细胞活性成分的生理盐水可以置于-20℃保存。所述的表皮干细胞专用培养基是在含体积分数5～10%胎牛血清的M199培养基中加入生长因子与抗生素组合物配制而成的，其中，所述生长因子包括谷氨酰胺、谷丙酸钠和Endogro细胞因子，抗生素为青链霉素，所述谷氨酰胺在培养基中的浓度为100～200mmol/L，谷丙酸钠在培养基中的浓度为5～10mmol/L，Endogro细胞因子在培养基中的浓度为5～10µmol/L，所述青链霉素在培养基中的浓度各自为100IU/mL。所述专用培养基中含有皮肤干细胞生长特需的营养成分谷氨酰胺和Endogro细胞因子以及双抗，能够有效促进细胞增殖，增强细胞免疫力，维持细胞良好的生长态势。青链霉素的加入能够防止细胞生菌，保证表皮干细胞分泌液的健康无污染。本专利技术选用复温的质量终浓度为0.25%的不含EDTA的胰酶消化细胞进行传代，该胰酶较含EDTA的0.25%的胰酶更温和，对细胞损伤更小，细胞结构更完整。本专利技术调整了复合胶原酶的组成配比，并生理盐水作为提取过程的平衡试本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种皮肤干细胞活性成分的提取方法，是用生理盐水将人源性皮肤组织清洗干净，机械破碎，加入添加有PMSF蛋白酶抑制剂的Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的生理盐水混合消化液中，37℃恒温摇床培养，以含体积分数10%胎牛血清的M199 培养基终止消化，收集消化液，离心收集沉淀，以生理盐水重悬细胞，得到复合皮肤干细胞；应用磁珠标记的Dlk抗体和Sca1抗体，以磁珠筛选法从复合皮肤干细胞中筛选出Dlk1+/Sca1−皮肤干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种皮肤干细胞活性成分的提取方法，是用生理盐水将人源性皮肤组织清洗干净，机械破碎，加入添加有PMSF蛋白酶抑制剂的Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的生理盐水混合消化液中，37℃恒温摇床培养，以含体积分数10%胎牛血清的M199培养基终止消化，收集消化液，离心收集沉淀，以生理盐水重悬细胞，得到复合皮肤干细胞；应用磁珠标记的Dlk抗体和Sca1抗体，以磁珠筛选法从复合皮肤干细胞中筛选出Dlk1+/Sca1−皮肤干细胞。2.根据权利要求1所述的皮肤干细胞活性成分的提取方法，其中所述的混合消化液是配制总质量浓度为0.25%的Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的生理盐水溶液，加入溶液质量1%的PMSF蛋白酶抑制剂，调节溶液的pH值为7.2～7.4得到。3.根据权利要求2所述的皮肤干细胞活性成分的提取方法，其特征是所述混合消化液中Ⅰ型胶原酶与Ⅱ型胶原酶的质量比为1∶1。4.根据权利要求1所述的皮肤干细胞活性成分的提取方法，其特征是将所述混合消化液在摇床上以100～200r/min的转速培养30～50min。5.根据权利要求1所述的皮肤干细胞活性成分的提取方法，其特征是以下述方法培养所述皮肤干细胞活性成分：...

【专利技术属性】
技术研发人员：于保锋，孟凡秀，张琪，解军，曹睿，温晓薇，杨巧艳，加三三，温丽敏，白欣艳，姚志坚，曾思衡，袁洋洋，张紫燕，张丽娜，王萱，田九博，马培元，刘志贞，傅松涛，杨丽红，郭睿，王惠珍，徐钧，刁海鹏，陈显久，胡晓年，弓韬，王海龙，赵虹，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：山西;14