一种牙髓干细胞分离培养方法技术

本发明专利技术涉及牙髓干细胞分离培养领域，公开了一种牙髓干细胞分离培养方法，包括以下步骤：将牙齿挤碎，露出牙髓组织，再将牙髓组织剪碎，收集到离心管中，使用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶分解牙髓组织；加入完全培养液终止分解，离心去上层清液，再用完全培养液将细胞重悬，过滤获得原代细胞悬液；原代细胞种植密度采用1×104/cm2；2天后进行首次换液，后面3天换一次，培养9至19天，每个原代细胞形成数目100左右的克隆细胞，进行细胞收获及传代；按照1×4000/cm2种植传代细胞，待细胞达到70～90％的汇合度，进行细胞收获并再次传代。本发明专利技术通过规范牙髓干细胞分离培养的方法及具体操作中的各项参数，提高牙髓干细胞分离培养效率、产出率，降低生产成本。

Method for separating and culturing dental pulp stem cells

The present invention relates to the field of dental pulp stem cells were isolated and cultured, discloses a dental pulp stem cell isolation and culture method, which comprises the following steps: crushing teeth, exposed dental pulp, the pulp tissue was cut, collected in centrifuge tubes, using type I collagenase and neutral protease. The pulp; adding complete medium termination to decompose, centrifugal supernatant, and then completely cultured cells were resuspended and filtered to obtain primary cell suspension; primary cell density by 1 * 104/cm2; 2 days after the first medium change, change after a 3 day training, 9 to 19 days, each primary cell number about 100 clone formation cells, cells were harvested and passaged; according to the 1 * 4000/cm2 plant cells when the cells reached 70 ~ 90% degree of confluence, cells were harvested and passaged again. The invention improves the efficiency of separating and culturing the pulp stem cells and reduces the production cost by standardizing the methods of separating and culturing the dental pulp stem cells and various parameters in the specific operation.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及牙髓干细胞分离培养领域，尤其涉及一种牙髓干细胞分离培养方法。
技术介绍
干细胞储存业务从单纯的脐带血储存发展到现今的脐带、胎盘、牙齿等多种来源的干细胞储存，其重要性和必要性已经为越来越多的人所认可。然而仍有相当多的孩子，由于其父母从前对干细胞的认识不足，从而失去第一次为孩子储存脐带血干细胞或是脐带干细胞的时机，而乳牙干细胞储存业务的开展可以弥补这一遗憾，为孩子的健康买一份保险。牙髓干细胞可应用于牙髓再生，骨骼再生，神经细胞再生，心肌、血管再生等。体外培养的牙髓干细胞，无论是细胞增殖能力还是克隆形成率都要强于骨髓来源的间充质干细胞。但是目前对于牙髓干细胞的培养，却缺乏一套完整的体系，牙髓干细胞的培养效果并不理想。
技术实现思路
为了解决上述不足，本专利技术提供一种牙髓干细胞分离培养方法，通过建立一套完整的牙髓干细胞分离培养体系，提高牙髓干细胞的培养效率，其技术方案如下：S1，分离干细胞，将牙齿用灭菌过的纱布包裹住，置于台钳中，挤碎牙齿露出牙髓组织，将牙髓组织用剪刀剪碎，收集到离心管中，加入完全培养液保湿，使用1:1的3mg/mL的Ⅰ型胶原酶和4mg/mL的中性蛋白酶在37℃分解牙髓组织30min；S2，制备单细胞悬液，加入5倍于Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶总体积的完全培养液来终止分解，采用1000rpm离心10min，去除上层清液，再用完全培养液将细胞重悬，使用70μm的滤网过滤获得原代细胞悬液；S3，细胞种瓶，原代细胞种植密度采用1×104cell/cm2，或者按照一颗牙齿种植一个T25培养瓶；S4，形成克隆，2天后进行首次换液，后面完全培养液每3天换一次，培养9至19天，每个原代细胞形成数目100左右的克隆细胞，进行原代细胞收获及传代；S5，细胞传代，按照1×4000cell/cm2种植传代细胞，间隔3至4天换液，待细胞生长达到70～90％的汇合度时，进行传代细胞收获并再次传代。进一步，在S1步骤中，牙齿采用新鲜牛奶或者无菌生理盐水保存，或者添加S/P抗生素的PBS缓冲液，在1℃至5℃之间的温度进行保存，保存时间不超过48h。进一步，在S1步骤中，清洁牙齿时，需要将牙齿表面的牙龈和周围的组织刮去，依次使用碘酒和70％酒精清洁牙齿表面，防止口腔细菌的污染，之后再用生理盐水洗涤5次，去除碘酒和酒精。进一步，在S4步骤中，首次换液时需移除没有贴壁的细胞。进一步，在S5步骤中，细胞的传代收获采用第二代至第四代传代细胞。进一步，在S1至S5步骤中，细胞的培养温度为37℃，CO2的体积百分比为5％。本专利技术提供的牙髓干细胞分离培养方法可以通过规范牙髓干细胞分离培养的步骤以及具体的操作中的各项参数，建立一套完整的牙髓干细胞分离培养体系，提高牙髓干细胞分离培养效率、产出率，降低生产成本。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为牙髓干细胞分离培养步骤示意图；图2为完全培养液培养牙髓DPSCs细胞状态示意图；图3为牙髓干细胞倍增时间；图4为牙髓干细胞倍增时间趋势。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供一种牙髓干细胞分离培养方法，通过建立一套完整的牙髓干细胞分离培养体系，提高牙髓干细胞的培养效率，包括以下步骤。如图1，S1，分离干细胞：将牙齿用灭菌过的纱布包裹住，置于台钳中，挤碎牙齿露出牙髓组织，将牙髓组织用剪刀剪碎，收集到离心管中，加入完全培养液保湿，使用Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶在37℃分解牙髓组织30～45min。Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶的使用属于本领域的公知技术，仅仅浓度和比例的不同，需要根据实际情况调整，在本实施例中，所述Ⅰ型胶原酶的浓度为3mg/mL，所述中性蛋白酶的浓度为4mg/mL，两者的体积比为1:1。在实际实验过程中，发现分解时间过长，细胞的收获率不见得有明显提高，并且影响收获细胞的活率，因此本实施例采用最短消化时间，30min。在S1步骤中，牙齿采用新鲜牛奶或者无菌生理盐水保存，或者添加S/P抗生素的PBS缓冲液(牙髓腔完整)，在1℃至5℃之间的温度进行保存，保存时间不超过48h。清洁牙齿时，需要将牙齿表面的牙龈和周围的组织刮去，依次使用碘酒和70％酒精清洁牙齿表面，防止口腔细菌的污染，之后再用生理盐水洗涤5次，去除碘酒和酒精。S2，制备单细胞悬液：加入5倍于Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶总体积的完全培养液来终止分解，采用1000rpm离心10min，去除上层清液，再用完全培养液将细胞重悬，使用70μm的滤网过滤获得原代细胞悬液。在本实施例中，所述完全培养液为α～MEM(MinimumEssentialMedium)培养液，属于本领域的公知技术。S3，细胞种瓶：原代细胞种植密度采用1×104cell/cm2，或者按照一颗牙齿种植一个T25培养瓶。一般文献提及的原代种植密度(包括研究最多的骨髓MSCs)为(0.5～4)×105cell/cm2，一般只能种植1well(6～well细胞培养皿)或者1个T25培养瓶，细胞数目不足以设立培养梯度；另采用过更低原代种植密度，很难形成克隆集落，或者经历很长时间方可长出稀散的克隆，细胞也容易呈现老化状态，因此一般采用一颗牙齿牙髓细胞种植1个T25培养瓶；首次换液时间，采用种植48h之后进行换液。此时培养液的营养成分丧失不至于很多，也易于观察培养过程中是否发生污染情况，同时能去除非特异的贴壁细胞。S4，形成克隆：2天后进行首次换液，后面完全培养液每3天换一次，培养9至19天，每个原代细胞形成数目100左右的克隆细胞，进行原代细胞收获及传代，首次换液时需移除没有贴壁的细胞。S5，细胞传代：按照1×4000cell/cm2种植传代细胞，间隔3至4天换液，待细胞生长达到70～90％的汇合度时，进行传代细胞收获并再次传代。如图2，应用此传代密度进行细胞的培养，细胞形态较好，如图3及图4，倍增时间与倍增次数也保持较好状态，传代至第6代时细胞状态仍然较好。如图3及图4，原代细胞形态呈短梭形或圆形，传代至P1、P2代，细胞形态仍然呈较为幼稚的短梭形或圆形，P4代开始出现呈长梭形的老化细胞，老化细胞所占比例很低，P6代开始逐渐出现宽大扁平的老化细胞。所以在本实施例中，细胞的传代收获采用第二代至第四代传代细胞。在本实施例中，S1至S5步骤操作时，细胞的培养温度均保持在37℃，CO2的体积百分比保持在5％。本专利技术提供的牙髓干细胞分离培养方法可以通过规范牙髓干细胞分离培养的步骤以及具体的操作中的各项参数，建立一套完整的牙髓干细胞分离培养体系，提高牙髓干细胞分离培养效率、产出率，降低生产成本。以上所述，仅是本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术作任何形式上的限制，任何未脱离本专利技术技术方案内容，依据本专利技术的技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牙髓干细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，分离干细胞，将牙齿用灭菌过的纱布包裹住，置于台钳中，挤碎牙齿露出牙髓组织，将牙髓组织用剪刀剪碎，收集到离心管中，加入完全培养液保湿，使用1:1的3mg/mL的Ⅰ型胶原酶和4mg/mL的中性蛋白酶在37℃分解牙髓组织30min；S2，制备单细胞悬液，加入5倍于Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶总体积的完全培养液来终止分解，采用1000rpm离心10min，去除上层清液，再用完全培养液将细胞重悬，使用70μm的滤网过滤获得原代细胞悬液；S3，细胞种瓶，原代细胞种植密度采1×104cell/cm2，或者按照一颗牙齿种植一个T25培养瓶；S4，形成克隆，2天后进行首次换液，后面完全培养液每3天换一次，培养9至19天，每个原代细胞形成数目100左右的克隆细胞，进行原代细胞收获及传代；S5，细胞传代，按1×4000cell/cm2种植传代细胞，间隔3至4天换液，待细胞生长达到70％～90％的汇合度时，进行传代细胞收获并再次传代。

【技术特征摘要】
1.一种牙髓干细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，分离干细胞，将牙齿用灭菌过的纱布包裹住，置于台钳中，挤碎牙齿露出牙髓组织，将牙髓组织用剪刀剪碎，收集到离心管中，加入完全培养液保湿，使用1:1的3mg/mL的Ⅰ型胶原酶和4mg/mL的中性蛋白酶在37℃分解牙髓组织30min；S2，制备单细胞悬液，加入5倍于Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶总体积的完全培养液来终止分解，采用1000rpm离心10min，去除上层清液，再用完全培养液将细胞重悬，使用70μm的滤网过滤获得原代细胞悬液；S3，细胞种瓶，原代细胞种植密度采1×104cell/cm2，或者按照一颗牙齿种植一个T25培养瓶；S4，形成克隆，2天后进行首次换液，后面完全培养液每3天换一次，培养9至19天，每个原代细胞形成数目100左右的克隆细胞，进行原代细胞收获及传代；S5，细胞传代，按1×4000cell/cm2种植传代细胞，间隔3至4天换液，待细胞生...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凤宁，
申请(专利权)人：贵州泛特尔细胞生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：贵州;52