hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法，包括以下步骤：步骤一、原代人牙周膜干细胞(hPDLSC)的培养：步骤二、稳定表达hTERT基因的永生化基因工程细胞系hTERT-PDLSC构建：本发明专利技术利用表达hTERT基因的慢病毒载体，在一定条件下将其感染原代培养的PDLSC，经过嘌呤霉素的抗性筛选，得到稳定表达hTERT基因的永生化细胞系，能够将细胞使用寿命从3-8代延长至35代，得到性质稳定、功能良好、表型正常的永生化细胞模型；本发明专利技术在研究牙周膜干细胞对于牙周组织工程、研发有效的治疗牙周炎的药物方面具有有益效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞工程、基因工程和永生化
，特别涉及一种hTERT慢病毒 重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法，主要为人牙周膜干细胞的原代培养和鉴定、通过 慢病毒载体构建稳定表达人端粒酶逆转录酶hTERT基因的细胞系，以及细胞系功能学和转 化性的检测。
技术介绍
慢性牙周炎（chronic periodontitis)作为人类口腔中常见的多发病，会依次 出现牙周支持组织的炎症、出血，牙周附着丧失，牙周袋形成，牙槽骨破坏和吸收，最终引 起牙齿松动和脱落，严重影响人类了生理和心理健康。从牙周组织的解剖结构看，牙周膜 (periodontal Iigameni^F1DL)是被新生牙槽骨和牙骨质所围绕的结缔组织。牙周膜细胞 (periodontal ligament cells, PDLC)是F1DL的主要细胞群体，包括成纤维细胞、成牙骨质 细胞、成骨细胞和破骨细胞、未分化间充质细胞。I3DLC可表现多能成体干细胞特征，这取决 于其中未分化间充质干细胞的存在，使其具有很强的增殖能力（可连续传数代和形成细胞 克隆），还可分化成其他细胞，对牙周骨组织的稳态和再生重建有重大意义。Seo等在2004 年首次通过单细胞克隆培养的方法将牙周膜细胞群体中具有间充质干细胞功能的一组细 胞分离并鉴定后正式命名为牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，F1DLSC), 该细胞可表达间充质干细胞标记物：基质细胞抗原-I (STR0-1)、细胞黏附分子CD146和 MUC18,克隆形成率高，可分化为成牙骨质细胞、脂肪细胞和成纤维细胞，植入免疫缺陷鼠中 则可形成牙周韧带样结缔组织及牙骨质样结构。Gay也证实TOLSC不仅能分化为成牙骨质 样和成骨样细胞，还可分化为成纤维样细胞，形成形态结构、空间排列类似天然牙骨质-牙 周膜-骨样的复合体结构。这就说明：在异质性的牙周膜细胞群中确实存在着一部分间充 质干细胞即牙周膜干细胞，其处于未分化状态并能够在不同的诱导条件下分化为牙周膜成 纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞，而牙周膜组织则是该干细胞的储池。因此TOLSC作为 牙周组织工程种子细胞对牙周新附着的形成具有重要的研宄和应用价值。随着分子生物学 技术的大力发展，hPDLSC可向特定方向进行诱导和分化，或进行相关基因修饰，从而为牙 周组织的再生开辟更为广阔的应用前景：作为种子细胞构建组织工程化牙周膜组织；使种 植体周围的骨组织界面形成真正意义的牙周结缔组织；与其他口腔种子细胞一起联合构建 组织工程化牙根甚至完整的牙齿结构。但是目前hPDLSC也还有许多问题亟待解决：（1)细 胞容易受到环境、炎症、免疫和年龄等外界因素的影响而导致不稳定；（2)干细胞分离纯化 与鉴别技术尚不成熟，获得的细胞数量较少；（3)传代次数受限，随着细胞不断传代，其分 化、增殖能力逐渐下降，同时干细胞特征也会丧失，大大限制了 hPDLSC的进一步应用；(4) 牙周组织形成过程非常复杂，利用hPDLSC在有限的时间内形成正常结构和功能的牙周组 织需要漫长的过程，受到活体内其他各种因素的影响；（5)某些个体情况特殊，如DNA变异 使自体干细胞出现缺陷而不能作为种子细胞时，就需要进行异体移植，因此而导致异质性 来源的排斥、道德伦理和传染性疾病等也有待解决；(6)hPDLSC具有多向分化潜能和高度 增殖能力，但目前的技术如不能精确控制其形成特定目的细胞，不排除有导致畸胎瘤的危 险。 细胞永生化（cell immortalization)指在体外环境培养的细胞受到自发的或外 界其他因素的干扰后，能逃离增殖衰老危机，从而具有无限增殖能力的过程。正常细胞发生 自发性永生化的概率很小，啮齿类的动物大约为1〇_5-1〇_6,人类细胞则更低小于1〇_ 12,因此 大都通过转入外源性的永生化基因来获得细胞永生化状态。传统技术通过将外源性的永生 化基因，如病毒（SV40、EBV)、原癌基因（Myc、Mdm2)和抑癌基因突变体（p53和pRb)等利用 基因转染等技术导入目的细胞内来增加永生化发生的概率，建立无限增殖且表型稳定的永 生化细胞株，为组织工程学、临床研宄等提供性质稳定、功能良好的种子细胞。近年来大量 研宄发现细胞的永生化与端粒（telomere)和端粒酶（telomerase)密切联系。端粒对于维 持细胞寿命起着至关重要的作用，除了能够保持染色体的完整性，还对细胞生存期限起到 关键性调控作用，而端粒功能障碍则会导致细胞增殖衰竭或凋亡。在体外培养过程中，随 着细胞的不断分裂、传代，端粒长度呈现进行性的缩短而引发细胞衰老。因此，如何维持细 胞端粒长度的稳定就成为研宄的关键。影响端粒长度的因素有很多，而端粒酶被认为是维 持端粒的结构和长度稳定的关键影响因子，在细胞永生化过程中发挥重要作用，其他的蛋 白和细胞因子等都可以通过调节端粒酶的活性影响端粒长度，因此端粒酶成为永生化研宄 的热点。虽然端粒酶的激活可能是多种细胞因子参与的复杂调节过程，但端粒酶逆转录酶 (telomerase reverse transcriptase, TERT)作为端粒酶中最重要的功能单位与这些调控 息息相关。端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖核蛋白酶，由RNA和相关蛋白质组成，于 1985年由Blackburn首次从四膜虫细胞提取物中发现，能以自身RNA为模板而不依赖DNA 聚合酶，从端粒DNA的3' -OH末端延伸端粒或合成新的端粒DNA重复序列来维持端粒恒定 长度，补偿细胞不断分裂时染色体末端的进行性缩短，防止细胞出现凋亡。即端粒酶具有特 殊能力可以"自主"对端粒DNA中富含G的链进行延长，再通过"G-G配对"原则将终端回 折形成特殊的发卡结构，使端粒DNA复制时新链5'端缺失得到补齐。正常情况下体细胞端 粒酶表达受到严格调控，呈现瞬时表达或者低水平，不能检测到活性，细胞会衰老和死亡， 而多数恶性肿瘤组织和永生化细胞中端粒酶活性为阳性表达，因此端粒酶的激活与肿瘤的 发生密切相关。活性端粒酶由三部分组成：端粒酶RNA(telomerase RNA，TR)、端粒酶相关 蛋白（telomerase-associated protein, TEP)和端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT)。哺乳动物TERT的转录由许多转录因子、激素、细胞外信号严格控 制，不同转录因子调节TERT在不同细胞内含物中表达，而TERT启动子上游HPV增强子的 整合可顺式激活TERT基因转录，这种顺式激活作用是TERT基因转录端粒酶调节的原发机 制。原代培养细胞如能稳定表达TERT基因就能稳定端粒的长度，从而使细胞达到永生化状 态，因此TERT的激活是细胞永生化的关键。相对于将SV40病毒或原癌基因 myc、抑癌基因 P53等导入目的细胞来建立永生化细胞系的传统方法，转入外源性TERT基因使细胞达到永 生化具有很多优点：第一、TERT介导的永生化细胞属于正常细胞，而不是转化细胞，其生长 特征、转化性和正常细胞一致；第二、端粒和端粒酶可以使细胞跨越细胞周期的Ml期和M2 期，维持端粒在恒定的长度，恢复染色体的稳定性，使细胞获得无限增本文档来自技高网...
【技术保护点】
hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、原代人牙周膜干细胞(hPDLSC)的培养：收集拔除的前磨牙，刮取牙根中1/3牙周膜组织，800rpm离心5min后，沉淀中并按照1个牙取得的组织都加1mL Ⅰ型胶原酶吹打混匀，置于37℃,5％CO2,饱和湿度的标准环境细胞培养箱消化至组织松散，每隔3‑5d更换正常培养液一次，正常培养液成分为：体积比79％的DMEM/F12培养基中加入体积比为20％的胎牛血清，体积比为1％的三抗混匀，待有细胞克隆出现，用滤纸片挑取细胞克隆扩大培养，扩大培养的方式是消毒干燥的滤纸片沾湿0.2％胰酶后于克隆位置消化5‑10秒，利用滤纸片将消化下的细胞转移至新的培养皿中继续培养，得到的第3代生长状态佳的人牙周膜干细胞hPDLSC为长梭形、呈放射状生长；步骤二、稳定表达hTERT基因的永生化基因工程细胞系hTERT‑PDLSC构建：取步骤一培养得到的第3代生长状态佳的hPDLSC消化后接种于24孔板，每孔500μL；24h后待细胞贴壁生长，然后再在每孔中加增强感染效率的试剂Enhanced infection solution ENi.S.原液243.25μL、10mg/mL聚凝胺polybrene 0.25μL，以及按照MOI＝65加入携带hTERT基因1*105TU/μL的慢病毒原液6.5μL，混合均匀混合均匀；24h后换正常培养液，2d后再换含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基，隔2d用含2μg/mL嘌呤霉素的培养基再换1次，培养观察4d，待未感染细胞在嘌呤霉素作用下全部死亡，再换正常培养基静置培养，每3d换液1次；直到有抗性细胞克隆出现，滤纸片挑取克隆进行扩大培养，得到稳定的感染细胞为长梭形。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李昂，刘瑾，苟建重，王嗣岑，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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