一种牙周膜干细胞的骨向诱导方法技术

本发明专利技术提供一种牙周膜干细胞的骨向诱导方法：取从健康患者拔除的第三磨牙或前磨牙为原料，分离和培养出PDLSCs；将PDLSCs接种于骨向诱导分化培养基中，接种量为2.0×104/cm2，然后置于37℃细胞培养箱进行诱导分化2周，其中骨向诱导分化培养基的配方为基础培养基添加10–3mol/L淫羊藿苷、10-6mol/L大黄素、10-5mol/L葛根素、10-6mol/L小檗碱、10-5mol/L杜仲醇提取物、2mg/L骨碎补总黄酮、4mg/mL补骨脂素、4mg/mL齐墩果酸及10-6mol/L川续断皂苷Ⅵ。该方法能成功实现对PDLSCs的骨向诱导，且不影响PDLSCs的干细胞特性和免疫学特性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学与细胞生物
，具体涉及。
技术介绍
牙周炎是口腔科临床的常见病，是以牙周组织破坏为主要特征的感染性疾病，临床主要表现为牙龈的炎症和出血、牙周袋的形成、牙槽骨吸收及牙齿松动、移位直至丧失。牙周炎在人群中普遍存在，其中慢性牙周炎达60%以上，侵袭性牙周炎为5% -15%，而且牙周炎占拔牙原因的30% -44%。牙周炎不仅是牙齿丧失的主要原因，而且与某些全身系统性疾病的发生发展有关，如糖尿病、心血管疾病等。一旦牙周附着和牙槽骨的破坏已经发生，最理想的方式是完整地重建健康的牙周组织、形成牙周新附着和新骨，但因牙周炎丧失的牙周组织特别是骨组织，其修复与重建的难度很大，故牙周炎的治疗一直是口腔临床研究的重点和难点之一。 目前，临床常采用的牙周炎治疗方法包括:牙周基础治疗(洁治、刮治、根面平整)、牙周翻瓣术及牙周组织再生术等，但是这些方法仅能缓解患者症状、阻止疾病的进一步发展，尚不能完整的重建健康的牙周组织，即不能治愈牙周炎。 美国科学家研究表明人牙周膜组织中包含较多的单克隆干细胞，将其称为牙周膜干细胞(per1dontal ligament stem cells, F1DLSCs), F1DLSCs 具有较高的克隆形成能力和细胞增殖力，具有分化为脂肪细胞和成纤维细胞的能力，表达间充质干细胞的标志物STR0-1和⑶146。当将其移植至免疫缺陷的小鼠，PDLSCs能产生沿牙周膜结缔组织方向走行的牙骨质样结构，提示ToLSCs是干细胞介导的牙周病治疗的潜在细胞来源。 而要完成骨向分化roLSCs的异体应用，骨向分化roLSCs的干细胞特性和免疫学特性是又一必须面对和不得不解决的问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，该方法能够成功实现对roLSCs的骨向诱导，且不影响roLSCs的干细胞特性和免疫学特性。 本专利技术所采用的技术方案为: ，它包括以下步骤: S1:取从健康患者拔除的第三磨牙或前磨牙为原料，分离和培养出roLSCs ； S2:将得到的roLSCs接种于骨向诱导分化培养基中，接种量为2.0 X 1Vcm2,然后置于37°c细胞培养箱进行诱导分化2周，其中骨向诱导分化培养基的配方为基础培养基添加 10 ^ 3mol/L 淫羊藿苷、lCT6mol/L 大黄素、lCT5mol/L 葛根素、lCT6mol/L 小檗碱、lCT5mol/L 杜仲醇提取物、2mg/L骨碎补总黄酮、4mg/mL补骨脂素、4mg/mL齐墩果酸及l(T6mol/L川续断皂苷VI。 所述S2步骤中基础培养基的配方为a -MEM液体培养基。 与现有技术相比，本专利技术具有以下显著优点和有益效果: (I)本专利技术采用特殊配方的培养基，在基础培养基中添加特殊的中药材成分，成功将roLSCs实现骨向诱导分化，得到的骨向分化牙周膜干细胞经实验证实仍然具有干细胞特性，且具有低免疫原性和免疫抑制特征；roLscs如果在体内分化为骨组织，则能够形成新骨，修复被牙周炎破坏而形成的骨缺损，从而成为有效治疗牙周炎的一种新方法。 (2)目前牙周炎在中老年人发病率较高，但是患有牙周炎的中老年人的自体PDLSCs十分有限，我们不能拔除患者的一颗健康牙齿、分离培养TOLSCs来治疗牙周炎，这样将会得不偿失，本专利技术采用青少年在进行牙齿正畸治疗时需要拔除而作为医疗废弃物被扔掉的健康的前磨牙和第三磨牙为原料，分离培养roLSCs，进行骨向诱导方法，不仅有效实现了医疗废弃物的再利用，且如果roLSCs能异体应用，就明显扩大了 roLSCs的来源，会极大推进牙周炎治疗的发展。 【附图说明】 图1所示的是实施例3(roLSCs可以进行骨向分化)的实验结果，其中A:骨向诱导I天roLSCs和未诱导roLSCs的碱性磷酸酶活性相近，而骨向诱导3天roLSCs的碱性磷酸酶活性明显升高，骨向诱导7天roLSCs的碱性磷酸酶活性则有显著升高；B:RT-PCR发现，骨向诱导2周后，PDLSCs高表达OCN、BSP和Msxl这三个骨组织的标志物；C =PDLSCs在骨向诱导4周后，Von-kossa钙质染色呈现较多的棕褐色阳性反应区域；D:未分化TOLSCs进行Von-kossa钙质染色时并没有出现阳性反应。白色柱:未分化TOLSCs ;黑色柱:骨向分化TOLSCs ；ALP:碱性磷酸酶；BSP:骨涎蛋白；0CN:骨钙素；Msxl:同源盒蛋白；NS:无显著性差异；*P<0.05，**ρ〈0.01 ;图 C、D 的倍数:400 倍。 图2所示的是实施例4的实验结果，其中流式细胞术发现，PDLSCs不表达造血谱系细胞的标志物⑶14 (A)，⑶34 (B)和⑶45 (C)，仍然表达间充质干细胞的标志物STR0-1 (D)、CD90 (E)和 CD 146 (F)，阳性率分别为 14.9%,72.73% 和 86.24% ? 图3所示的是实施例5的实验结果，其中A:骨向分化2周的TOLSCs没有引起T淋巴细胞的增殖，表明其具有低免疫原性:骨向分化2周的TOLSCs显著抑制了丝裂原PHA引起的异体T淋巴细胞增殖；NS:无显著性差异；PBMCs:外周血单个核细胞；PHA:植物血凝素；MLR:混合淋巴细胞反应；*p〈0.01。 图4所示的是实施例5中前列腺素E2在骨向分化TOLSCs的免疫抑制特性中发挥重要作用的示意图:建立骨向分化2周的PDLSCs+等量异体PBMCs+PHA的共同培养体系，然后分别加入抗TGF-beta抗体、抗肝细胞生长因子抗体、抗IL-10抗体、同型对照抗体、N-硝基-L-精氨酸甲酯(诱导型NO合成酶的抑制剂)、1-甲基-L-色氨酸(吲哚胺-2，3- 二氧化酶的抑制剂)、吲哚美辛(前列腺素E2的抑制剂)，结果发现，只有在加入前列腺素E2抑制剂的体系中，被骨向分化2周TOLSCs抑制的T淋巴细胞重新发生了增殖；PBMCs:外周血单个核细胞；PHA:植物血凝素；1_MT:1-甲基-L-色氨酸；L_NAME:N_硝基-L-精氨酸甲酯；TGF-beta:转化生长因子-beta ；HGF:肝细胞生长因子；IL_10:白细胞介素_10 ；NS:无显著性差异。 【具体实施方式】 以下结合实施例对本专利技术作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有说明，本专利技术使用的所有科学和技术术语具有与本专利技术所属
人员通常理解的相同含义。 实施例1:人PDLSCs的分离、培养: 选取拔除的健康患者的正常第三磨牙或者前磨牙(潍坊市益都中心医院口腔科门诊提供)，按照文献报道的方法分离和培养roLSCs。简述如下:将拔除的牙齿立即放入无菌装有预冷PBS的离心管，移送进细胞室，在24小时内分离培养roLSCs。轻轻剥离牙齿周围的牙周组织，取中段的牙周组织，用PBS反复清洗，剪碎，置于含I型胶原酶(3g/L)和中性蛋白酶(4g/L)的消化液，37°C下消化I小时，过70 μ m细胞筛收集细胞，1000转/分钟离心10分钟，用培养液重新悬浮成单细胞悬液。将单细胞悬液接种于25cm2细胞培养瓶中，在a -MEM培养基(含15%胎牛血清、100 μ mo I/L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牙周膜干细胞的骨向诱导方法，其特征在于包括以下步骤：S1：取从健康患者拔除的第三磨牙或前磨牙为原料，分离和培养出PDLSCs；S2：将得到的PDLSCs接种于骨向诱导分化培养基中，接种量为2.0×104/cm2，然后置于37℃细胞培养箱进行诱导分化2周，其中骨向诱导分化培养基的配方为基础培养基添加10–3mol/L淫羊藿苷、10‑6mol/L大黄素、10‑5mol/L葛根素、10‑6mol/L小檗碱、10‑5mol/L杜仲醇提取物、2mg/L骨碎补总黄酮、4mg/mL补骨脂素、4mg/mL齐墩果酸及10‑6mol/L川续断皂苷Ⅵ。

【技术特征摘要】
1.一种牙周膜干细胞的骨向诱导方法，其特征在于包括以下步骤: S1:取从健康患者拔除的第三磨牙或前磨牙为原料，分离和培养出roLSCs ； S2:将得到的roLSCs接种于骨向诱导分化培养基中，接种量为2.0X 104/cm2，然后置于37°C细胞培养箱进行诱导分化2周，其中骨向诱导分化培养基的配方为基础培养基添加lCT3mol/L 淫羊藿...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁刚，
申请(专利权)人：丁刚，
类型：发明
国别省市：山东;37