本发明专利技术涉及用于通过转座酶的DNA片段化和标记的方法和组合物。本发明专利技术提供了转座酶-介导的使DNA靶标片段化和标记的新组合物。本发明专利技术涉及在转座酶反应中使用锰离子(Mn2+)来改进转座酶反应的令人吃惊的发现。本发明专利技术还涉及Mg2+离子可以比先前预想的高很多的水平用于具有野生型和/或工程改造的转座酶的转座酶反应中的令人吃惊的发现。本发明专利技术提供了在体外反应中使用天然存在的转座酶，以及用于切割、标记和扩增靶标DNA的改进的方案。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域。更具体地，本专利技术涉及使用转座酶切割DNA分子并通过用感兴趣的预选择的序列标记分子来制备用于分析的切割的DNA分子的方法和组合物。尤其，本专利技术涉及核酸体外扩增、核酸测序和对感兴趣的序列进行DNA文库筛选的领域。 相关技术描述基因组DNA的片段化是在用于高通量测序的DNA样品制备中的关键步骤。传统使用的方法，例如使用DNase I的DNA片段化是非常不可靠的并通常导致DNA片段化不充分或者太昂贵。在任一情况中，有用尺寸(大约200-800个碱基对(bp))的DNA片段的产率都较低。该难点已通过使用寡核苷酸-转座酶复合体(例如来自Epicentre的NEXTERA 体系)控制DNA片段化来克服。此类复合体包含经修饰的Tn5转座酶的二聚物和含有19bp的转座酶-结合序列或反向重复序列(IR)的一对Tn-5结合双链DNA(dsDNA)寡核苷酸。在NEXTERA 体系中，使用了经工程改造的、非天然的19bp转座酶结合序列，其比天然Tn5IR序列提供了更有效的DNA片段化。该结合序列被称为“嵌合体”。不同于能靠单分子在靶标DNA中产生很多断裂的DNase，转座酶复合体被认为每个复合体仅产生一个DNA切割。因此，不同于使用DNaseI，DNA片段化的程度在转座酶片段化期间容易被控制。而且，与嵌合体序列结合的特异性核苷酸标记在该转座酶-介导的DNA片段化过程中可被附着，这对于PCR中的DNA扩增和将DNA片段附着至测序芯片是有用的。典型地，Mg(II)离子(本文中也称作Mg+2或Mg2+)被用作展示DNA片段化活性的酶的辅因子。这不是令人吃惊地，因为通过测验存在不同的金属离子时双螺旋DNA的融解温度，已确定对磷酸盐缔合的偏好被发现以Mg (I I) > Co (II) > Ni (II) > Mn (II) > Zn(II)> Cd(II) > Cu(II)的顺序减小。过渡金属复合体与多核苷酸的反应通常落在以下两类中(i)包括介导核酸氧化的金属复合体的氧化还原反应的那些反应；和(ii)包括使金属中心与糖-磷酸盐骨架配位以介导聚合物水解的那些反应。虽然Mg(II)是最强的结合剂，但未必是最优的辅因子。酶促DNA切割可被许多参数影响，特别是被依赖于与DNA结合的金属离子的性质的DNA构象影响。而且，具体的金属离子与酶本身的结合可影响蛋白构象、蛋白-蛋白相互作用(例如可能影响活性的蛋白二聚作用)；和蛋白-核酸相互作用，即，调节反应速度和和DNA切割特异性。迄今为止，已知适于DNA片段化和标记的仅有的转座酶是经修饰的Tn5转座酶。从一开始，Tn5转座酶在若干方面有问题。首先，天然转座酶实际上是不可能产生的，因为当从强启动子表达时，其对E. coli是有毒性的。但是，通过删除若干N-末端氨基酸来克服该难点是可能的(Weinreich et al. , J. Bacterial, 176 :5494-5504,1994)。虽然这解决了毒性问题，并且N-末端截短的转座酶被以高产率生产，但其具有非常低的活性。因此，若干其他突变被引入，以增大其活性(U.S. Patent 5, 965, 443 ；U. S. Patent 6，406，896BI；U. S. Patent 7，608，434)。但是，这不会解决所有的问题。突变酶仅在高盐(例如0. 7MNaCl)中是稳定的(Steiniger et al. , Nucl. Acids Res.，34 :2820_2832，2006)，但在转座酶反应所需的低盐条件下快速损失其活性，在反应混合物中具有仅仅2. 4min的半衰期。因而，使用该转座酶的DNA片段化反应典型地在5分钟内进行，并使用了非常大的量的酶。尽管事实上整个纯化过程保持了高盐浓度，但纯化的酶大量失活；因而，超过核苷酸9. 4倍过量的酶典型地被用来形成Tn5转座酶-寡核苷酸复合体(Na umann and Reznikoff, J. Bioi.Chem. ,277 :17623-17629，2002)。另外，转座酶容易蛋白水解降解。因此，有降解倾向的位点被突变。令人感兴趣地，这些突变导致体内活性的剧烈降低，但对体外活性几乎没有影响(Twining et al.，J. Bioi. Chem.，276 :23135-23143, 2001)。总之，Tn5 转座酶难于生产，其被大量需要并且其非常昂贵。
技术实现思路
本专利技术改进了使用转座酶的DNA片段化和标记的现有技术。在实施方式中，本专利技术提供新的反应条件，其包括锰离子代替镁离子，用于转座酶-介导的靶标核酸的切割和伴随的产生的DNA片段的标记。本专利技术因而将转座酶反应条件放宽至包括镁离子、锰离子或二者都包括。优选地，反应条件还包括相对低的碱性金属离子(例如钾离子)浓度。产生的标记的DNA片段在许多分子生物学应用领域有用，包括但不限于下一代测序、聚合酶链式反应(PCR)技术以及基因克隆和基因组分析。使用本文公开的反应条件，天然转座酶(即，具有不是不同于在自然中发现的氨基酸序列的氨基酸序列的转座酶；例如，非重组的)以及经修饰的转座酶(即，具有不同于在自然中发现的氨基酸序列的氨基酸序列的转座酶；例如，重组的)可在相对低的浓度和相对短的反应时间下用于体外DNA片段化和标记。天然转座酶可从天然或重组宿主中获得，而经修饰的转座酶仅可从重组宿主中获得。所述反应条件因而提供了优于当前技术的改进。本专利技术还对制备DNA底物用于下一代测序的现有技术进行改进。本专利技术提供制备此类DNA底物的新方法将产生的、连有用于DNA片段扩增的单独标记的引物的每一 DNA片段掺入两种不同的转座酶识别序列。所述方法允许仅使用两条引物来制备标记产物。在第一方面中，本专利技术提供了组合物，优选地，水性组合物，其包含转座酶和在从约ImM至约IOOmM或者甚至更高的浓度下的锰离子(Mn(II))。已令人吃惊地发现，较之使用典型地用在Tn5转座酶反应中的镁离子(Mg (I I))，使用在这些浓度下的Mn (I I)离子提供了优良的转座酶-介导的切割活性。但是，在本专利技术使用的条件下，镁离子可单独使用或与锰离子组合使用，以提供相对于使用含有MG(II)的反应组合物的现有技术的更优良的结果。的确，所述发现与转座酶的最佳活性在含有Mg+2的组合物中发现的本领域流行的观念相反(见，例如，www. epibio. com/item, asp id+292,其指出Tn5转座酶复合体在无Mg+2时无活性，而存在相对低的水平下的Mg+2时，有活性)。在优选的实施方式中，Mn(II)浓度、Mg(II)浓度或二者的浓度范围从约5mM至约40mM，例如从IOmM至约20mM。两种离子都存在时每种的浓度范围可从约ImM至约IOOOmM每种，例如从约5mM至约40mM,包括约IOmM至约20mM。通过专利技术人获得的数据显示这些浓度范围对人DNA和\噬菌体DNA 二者的片段化都同样适合。因而，看来在根据本专利技术的转座酶反应混合物中的Mn+2离子、Mg+2或二者的有优势的使用不限于特定类型的DNA的切割，而是相对广泛地可应用的。当然本领域技术人员会直接意识到在所公开范围内的Mn+2和Mg+2离子浓本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于靶标DNA分子的DNA片段化的体外方法，所述方法包括：使：包含至少一个双链部分的第一DNA分子，其中所述双链部分包含转座酶的识别序列并且该DNA分子还包含不包含该转座酶的识别序列的部分；包含至少一个双链部分的第二DNA分，其中双链部分包含上述转座酶的识别序列并且该DNA分子还包含不包含该转座酶识别序列的部分，其中所述序列的非识别部分不同于第一DNA分子的非识别部分；和上述转座酶组合；其中上述三种物质的组合允许它们相互作用；以及使这些相互作用的物质与靶标DNA分子和Mg+2离子、Mn+2离子、或Mg+2离子与Mn+2离子两者在使得相互作用的物质与靶标DNA缔合并通过转座酶？介导的切割来切割靶标DNA分子的条件下组合，以提供切割的DNA产物。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：亚历山大·S·贝尔亚夫，
申请(专利权)人：安捷伦科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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