一种报告蛋白质粒、细胞株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种报告蛋白质粒、细胞株及其构建方法与应用，报告蛋白质粒为pLVX

【技术实现步骤摘要】
一种报告蛋白质粒、细胞株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体地说，涉及一种报告蛋白质粒及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]流式细胞术(Flow CytoMetry，FCM)是一种用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选的生物学技术，该技术可用于对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。其特点是通过快速测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收来定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数。根据这些参数将不同性质的细胞分开，以获得供生物学和医学研究用的纯细胞群体。
[0003]报告基因是一类在细胞、组织/器官或个体处于特定情况下会表达并使得它们产生易于检测、且实验材料原本不会产生性状的基因，其中，荧光蛋白是一类可通过发射荧光，从而用于观测细胞活动，同时，可标记荧光蛋白，以进行深入的生物检测实验。特别是在癌症研究的过程中，由于荧光蛋白的出现使得科学家们能够观测到肿瘤细胞的具体活动，比如肿瘤细胞的成长、入侵、转移和新生。
[0004]传统检测细胞胰岛素信号通路通常采用western blot检测胰岛素处理前后胰岛素信号通路分子的磷酸化来鉴定。该方法需要1
‑
2天的时间，无法实时检测活细胞胰岛素信号实时变化，同时也无法做到高通量检测。
[0005]有鉴于此，提出一种具有更高荧光强度的报告基因蛋白成为当前亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]为此，本专利技术所要解决的技术问题在于传统荧光蛋白基因荧光强度不足、检测灵敏度不佳，从而提出一种荧光强度更高的报告蛋白质粒、细胞株及其构建方法与应用。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为：
[0008]本专利技术第一方面提供一种报告蛋白质粒，所述报告蛋白质粒为：pLVX
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CMV
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mClover3
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FHA2
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FOXOsig
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mRuby3
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IRES
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Hyg荧光蛋白。
[0009]作为优选，所述报告蛋白质粒的DNA序列为SEQ ID NO:1。
[0010]本专利技术第二方面提供所述的报告蛋白质粒的构建方法，其包括如下步骤：
[0011]S1、从pKanCMV
‑
mClover3
‑
mRuby3质粒获取mClover3
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mRuby3片段；
[0012]S2、将所述mClover3
‑
mRuby3片段插入pLVX
‑
IRES
‑
Hyg载体质粒中；
[0013]S3、通过点突变在mClover3、mRuby3之间获得酶切位点；
[0014]S4、设计合成FHA2
‑
FOXOsig片段，FOXOsig两端设有弹性铰链区；
[0015]S5、将所述FHA2
‑
FOXOsig片段组装于所述mClover3、mRuby3之间，得到所述pLVX
‑
CMV
‑
mClover3
‑
FHA2
‑
FOXO sig
‑
mRuby3
‑
IRES
‑
Hyg荧光蛋白。
[0016]作为优选，所述步骤S1具体为：将pKanCMV
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mClover3
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mRuby3质粒通过PCR扩增，获
取mClover3
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mRuby3片段，其中，PCR扩增中采用的正向引物的基因序列为SEQ ID NO:2，采用的反向引物的基因序列为SEQ ID NO:3。
[0017]作为优选，所述步骤S4具体为：通过PCR扩增获取FHA2
‑
FOXOsig片段，其中，PCR扩增中，采用的正向引物的基因序列为SEQ ID NO:4，采用的反向引物的基因序列为SEQ ID NO:5。
[0018]作为优选，所述FHA2
‑
FOXOsig片段由AKT下游分子FOXO信号多肽与FHA2融合表达而成。
[0019]本专利技术第三方面提供一种报告细胞株，其包括所述的报告蛋白质粒。
[0020]本专利技术第四方面提供一种构建所述的报告细胞株的方法，其包括如下步骤：
[0021]S1、报告蛋白质粒慢病毒包装：提取所述报告蛋白质粒，并进行Cas9慢病毒包装；
[0022]S2、构建表达AKT报告蛋白和Cas9的细胞株。
[0023]本专利技术第五方面提供一种所述的报告细胞株在流式细胞检测、荧光度板检测中的应用。
[0024]作为优选，所述应用还包括用胰岛素处理所述报告蛋白质粒的步骤。
[0025]本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0026]本专利技术提供的报告蛋白质粒，为pLVX
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CMV
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mClover3
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FHA2
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FOXOsig
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mRuby3
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IRES
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Hyg荧光蛋白，该报告蛋白质粒利用胰岛素代谢通路的AKT活化作为报告指标，AKT活化后，磷酸化下游分子FOXO信号肽(FOXOsig)，使FOXO信号肽与FHA2片段结合，使得融合在这两个分子两端的荧光蛋白mClover3和mRuby3相互靠近，当mClover3的激发光照后，发生荧光共振转移，检测到mRuby3的荧光信号。通过本专利技术提供的报告蛋白质粒，可用荧光读板机实时读取活细胞胰岛素信号，或者利用流式细胞技术进行高通量的细胞筛选。同时利用mClover3和mRuby3这对荧光蛋白作为荧光共振转移蛋白组合比其它荧光组合有更强的荧光强度，有利于提高检测灵敏度和检测精度。由该报告蛋白质粒构建的报告细胞株应用于流式细胞分选，可快速大量获取所需数据，显著提高了筛选分子机制研究的效率。
附图说明
[0027]为了使本专利技术的内容更容易被清楚的理解，下面根据本专利技术的具体实施例并结合附图，对本专利技术作进一步详细的说明，其中
[0028]图1是本专利技术实施例1提供的报告蛋白质粒的结构示意图；
[0029]图2是本专利技术实施例1提供的报告蛋白质粒的构建方法步骤图；
[0030]图3是荧光读板机测试不同时间胰岛素处理实施例2提供的报告细胞株的荧光强度图；
[0031]图4是荧光读板机测试不同浓度胰岛素处理实施例2提供的报告细胞株的荧光强度图；
[0032]图5是荧光读板机测试葡萄糖处理实施例2提供的报告细胞株的荧光强度图；
[0033]图6是流式细胞术检测胰岛素处理实施例2提供的报告细胞株的测试图；
[0034]图7是流式细胞术检测对照组报告细胞株的测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种报告蛋白质粒，其特征在于，所述报告蛋白质粒为：pLVX
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CMV
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mClover3
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FHA2
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FOXOsig
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mRuby3
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IRES
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Hyg荧光蛋白。2.根据权利要求1所述的报告蛋白质粒，其特征在于，所述报告蛋白质粒的DNA序列为SEQ ID NO:1。3.一种如权利要求1或2所述的报告蛋白质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、从pKanCMV
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mClover3
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mRuby3质粒获取mClover3
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mRuby3片段；S2、将所述mClover3
‑
mRuby3片段插入pLVX
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IRES
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Hyg载体质粒中；S3、通过点突变在mClover3、mRuby3之间获得酶切位点；S4、设计合成FHA2
‑
FOXOsig片段，FOXOsig两端设有弹性铰链区；S5、将所述FHA2
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FOXOsig片段组装于所述mClover3、mRuby3之间，得到所述pLVX
‑
CMV
‑
mClover3
‑
FHA2
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FOXO sig

【专利技术属性】
技术研发人员：黄宇虹，
申请(专利权)人：香港中文大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：