本发明专利技术提供了一种高效液相色谱-荧光法同时测定血清中酪氨酸、色氨酸和5-羟色胺含量的方法。本方法准确、快速，包括以下步骤：血清经5％的高氯酸去蛋白后采用高效液相色谱技术检测，其中色谱条件为：色谱柱规格为4.6mm×150mm?ID的Atlantis?C18柱；以0.1mol/L?KH2PO4—甲醇体积比85∶15混合溶液为流动相，流速为1.0ml/min；荧光检测器激发波长和发射波长0～4min分别为228nm和306nm，4～7.5min为278nm和338nm，7.5min后为285nm和353nm，在特定时间段调节波长对酪氨酸、5-羟色胺和色氨酸进行分离检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析化学领域，涉及一种定量测定血清中酪氨酸、色氨酸和5-羟色胺含量的研究方法，特别涉及一种运用高效液相色谱-荧光法同时测定血清中酪氨酸、色氨酸和5-羟色胺含量的相关技术。
技术介绍
酪氨酸(tyrosine，Tyr)属于人体的非必需氨基酸，由苯丙氨酸(phenylalanine， Phe)经苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)脱去羟基转化而来，是合成儿茶酚胺类神经递质-多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素的前体物质，与神经元的传递有重要关系。L-色氨酸(L-tryptophan，L-Trp)是人体内必需氨基酸之一，参与人体蛋白质合成和代谢调节，是5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5_HT)的前体物质，而5-HT是人体内重要的神经递质，可能是中枢神经系统病变的神经生物学基础。研究表明，Tyr、Trp和5-HT 三种氨基酸在人体神经精神系统中均发挥着重要的作用。目前，国内外报道测定Tyr、Trp和5-HT的方法有很多，其中，报道最多的为运用 HPLC法测定其中的一种或者两种进行测定，但未见采用HPLC-FLD同时测定血清中Tyr、Trp 和5-HT含量的报道，本专利技术利用Tyr、Trp和5-HT具有自然荧光的特性，在国内外首次公开一种同时测定血清Tyr、Trp和5-HT含量的HPLC-FLD，血清标本去蛋白后取上清直接进样， Tyr.Trp和5-HT通过色谱柱分离后，通过波长转换，在特定的时间段，以各自的最适荧光激发和发射波长进行检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是公开一种能够同时测定血清中Tyr、Trp和5-HT含量的HPLC-FLD 法，可满足医疗临床工作和科研对于Tyr、Trp和5-HT的快速、准确测定。以Atlantis C18色谱柱为固定相，所述色谱柱规格为4. 6mmX 150mm i.d. ,5ym； 以0. ImoVLKH2PO4 甲醇混合溶液为流动相，所述0. lmol/L KH2PO4与甲醇的体积比为 85 15;流动相pH值为4.3;流速为1.01111/1^11;将待测样品经色谱柱洗脱、分离后，用荧光检测器进行分析、测定；荧光检测器激发波长和发射波长0 ^iin分别为228nm和306nm， 4 7. 5min 为 278nm 和 338nm, 7. 5min 后为 285nm 和 353nm0所述的荧光检测器为多波长荧光检测器，具有多通道，可调波长的特点。所述的流动相使用前，用0. 22 μ M的微孔滤膜过滤，超声脱气20min。酪氨酸、色氨酸和5-羟色胺的标准工作液配制方法如下准确称取酪氨酸、色氨酸和5-羟色胺，用2. 5% ν/ν的高氯酸溶液溶解、混勻；分别配制成55 μ mol/L、49 μ mol/L、 1. 176 μ mol/L的标准工作液。待测血清样品的处理将空腹静脉血2ml于促凝管内，常温常速离心分离血清，取血清于印pendorf管内，加入等量5 %高氯酸溶液，充分混勻后室温放置lOmin，10000r/min 离心lOmin，取上清液20 μ L进样分析。本专利技术利用Tyr、Trp和5-HT三种氨氨基酸均具有自然荧光的特性，并经过大量实验条件的摸索，建立了一种能同时测定血清Tyr、Trp和5-HT含量的HPLC-FLD法，本方法简单、快速，血清标本去蛋白后，取上清液直接进样，Tyr、Trp和5-HT通过色谱柱分离后，采用波长转换，在特定的时间段，以各自的最适激发和发射波长进行检测，IOmin即可完成检测， 本专利技术明显优于已公开的技术，简便、快速、灵敏度高，无需柱前、柱后衍生；因此是一项非常值得广泛应用、推广的技术。附图说明图1为混合标准品Tyr、Trp和5-HT的色谱图；图2为正常成人血清样品Tyr、Trp和5_HT的色谱图。具体实施例方式下面结合实施方式和实施例旨在进一步说明本专利技术，而非限制本专利技术。本专利技术方法的建立过程1仪器和试剂仪器高效液相色谱仪包括Waters 510色谱泵和M75荧光检测器、Milli-Q纯水器、Rheodyne 7725手动进样器(带20 μ L进样环)、0. 22 μ m滤膜及其抽滤器。试剂L_Tyr、 L-Trp,5-HT, L_Phe、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、0. lmol/L KH2PO4和甲醇(色谱纯)。2Tyr、Trp和5-HT含量测定条件的选择2.1检测波长的选择本专利技术发现，通过对Tyr，5-HT和Trp激发光波谱范围QOOnm 450nm)和发射光波谱O50nm 500nm)扫描，得到各自的最适激发光波长和最适发射光波长，分别为228nm 和 306nm>278nm 和 338nm>285nm 和 353nm02. 2流动相中有机相甲醇含量的选择本专利技术发现，改变流动相中甲醇体积百分比(5^^10^^15^^20% )，以混合标准工作液作为样品进行分析，色谱图显示，随着甲醇含量的增加，Tyr、5-HT和Trp相应的保留时间均缩短。而当甲醇体积分数为5%时，分析时间较长，而当甲醇体积分数为20%时，分离效果不佳，在甲醇体积分数为15%时分离度较好，三者在IOmin内可以较好地分离，且分离度好，故采用含体积分数为15%甲醇的流动相。2. 3流动相PH值的选择本专利技术发现，加入冰乙酸调节PH，分别调至4. 0,5. 0和6. 0进行分析，发现不同 PH条件下，Tyr、Trp和5-HT的保留时间和峰面积没有明显改变，所以直接选择0. Imol/ LKH2PO4 甲醇(85 15, V V ;PH = 4. 3)溶液作为流动相。2. 4流动相流速的选择本专利技术发现，通过改变流动相的流速0. 6,0. 8,0. 9,1. 0,1. 2,1. 4ml/min。Tyr,Trp 和5-HT的保留时间明显缩短，但同时锋面积也相应减小，同时较大的流速也需要提供较大的泵压，使柱子承受较大的压力，综上考虑，选择流速为l.Oml/min最优。2. 5蛋白质沉淀剂的选择本专利技术发现分别选用5%的高氯酸、0. 6mol/L的三氯乙酸溶液(TCA)、0. 4mol/L 的磺基水杨酸溶液(SSA)做为蛋白质沉淀剂去除血清蛋白质，对血清进行测定。结果发现用SSA去蛋白的血清有干扰峰且严重影响Tyr、Trp和5-HT的测定，而高氯酸和三氯乙酸去蛋白的血清效果很好，本实验选择用高氯酸做沉淀剂。3. Tyr、Trp和5-HT的定性定量分析Tyr.Trp和5-HT采用峰保留值比较法和叠加法进行定性分析，即比对混合标准品和血清样品在相同条件下的色谱峰和相对保留时间。实验结果表明，在血清样品中加入标准品前后，三种Tyr、Trp和5-HT的出峰位置是一致的。用外标法测定峰面积进行定量分析，用公式表示为血清Tyr、Trp 或 5-ΗΤ 浓度=j X Cs X 2Au为血清中Tyr、Trp或5-HT峰面积；As为混合标准液中Tyr、Trp或5-HT峰面积；Cs为混合标准液中Tyr、Trp或5-HT浓度；4.方法学评价4. 1精密度的实验日内不精密度取混合血清，同一样本一天内连续测定20次；日间不精密度同一样本一天测一次，连续测定20天，计算日内、日间不精密度。见表1表lTyr、Trp和5-HT的日本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种高效液相色谱－荧光法同时测定血清中酪氨酸、色氨酸和５－羟色胺含量的方法，其特征在于，以Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｃ１８色谱柱为固定相，所述色谱柱规格为４．６ｍｍ×１５０ｍｍ ｉ．ｄ．，５μｍ；以０．１ｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４：甲醇混合溶液为流动相，所述０．１ｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４与甲醇的体积比为８５∶１５；流动相ｐＨ值为４．３；流速为１．０ｍｌ／ｍｉｎ；将待测样品经色谱柱洗脱、分离后，用荧光检测器进行分析、测定；荧光检测器激发波长和发射波长０～４ｍｉｎ分别为２２８ｎｍ和３０６ｎｍ，４～７．５ｍｉｎ为２７８ｎｍ和３３８ｎｍ，７．５ｍｉｎ后为２８５ｎｍ和３５３ｎｍ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐爱国，李影，穆萨，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：43
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