本发明专利技术涉及通过使衍生自真核细胞的微囊泡与负电荷磷脂例如磷脂酰丝氨酸接触，用于改善在真核细胞中表达的TF的促凝性质的方法。本发明专利技术还涉及使用所述方法获得的微囊泡以及其作为促凝血剂、用于伤口愈合和用于促进血管生成的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
一般来说，本专利技术涉及使用基于组织因子的促凝血剂治疗受试者中的出血和伤口愈合。更具体而言，本专利技术涉及包含以微囊泡形式的真核细胞衍生膜和组织因子蛋白质和负电荷磷脂(NCP)的荷有组织因子的微囊泡(荷有TF的微囊泡)，以及其作为促凝血剂用于治疗受试者中的出血以及促进血管生成和细胞迁移的应用。本专利技术进一步涉及用于产生所述荷有TF的微囊泡的方法。
技术介绍
止血是生物借助于其响应出血且涉及两个过程的参与的机制，所述两个过程在损伤后立即变得有功能且长时间段保持活性。其中第一个称为初次止血并且特征在于血管性损害部位血管收缩的出现和血小板聚集体形成。第二个称为二次止血，是其中由于不同凝血级联蛋白水解酶作用形成纤维蛋白凝块的时期。 都称为凝血因子的几种辅因子和蛋白水解酶参与血液凝固过程的第二个时期，并且它由几个时期组成，所述时期以来自由于凝血酶作用的纤维蛋白原水解的纤维蛋白形成结束。凝血酶先前通过脱辅基酶凝血酶原的蛋白酶解水解形成。这种蛋白酶解通过活化凝血因子X (FXa)执行，其与活化血小板的表面结合，并且仅在其辅因子活化凝血因子V(FVa)和钙离子的存在下，并且能够水解凝血酶原。凝血因子X (FX)活化可以以两个分开途径一一内源性途径和外源性途径出现。内源性途径由在其中水解每种酶原的一系列反应组成，获得其活性蛋白酶形式。在每个步骤中，新近形成的蛋白水解酶将催化随后酶原的作用，以相继获得活性形式。在血液凝固外源性途径中，在损害部位处的外膜细胞上表达的组织因子(TF)与循环凝血因子VII/活化凝血因子VII (FVII/FVIIa)结合，以形成TF: :FVIIa复合物，并且在钙的存在下，充当底物，从而使得FX活化发生。外源性途径目前认为是血液凝固中的最相关途径，并且公认在通过血管损害产生的出血事件中，由于涉及TF与其配体FVII/FVIIa的相互作用的外源性途径活化而触发凝血。已广泛公认TF是负责凝血由其起始的快速性的主要元件，并且它是FX活化所需的,这依次开始凝血酶原水解。已报道了来自多个组织的TF的纯化，例如人脑，牛脑；人胎盘；绵羊脑；和肺。广泛公认虽然在物种之间的TF蛋白质的结构中存在差异，但如通过体外凝血测定法测量的，不存在功能差异。广泛公认为了显示生物学活性，TF必须在体外与磷脂结合。已显示例如通过使用磷脂酶去除TF的磷脂组分导致其在体外生物学活性的丧失。W02008080989描述包含酵母膜和组织因子蛋白质的荷有组织因子的酵母衍生的微囊泡，及其作为促凝血剂在治疗受试者中的出血中的用途。W02006004675描述组织因子在植物细胞中的表达，得自表达TF的植物的粗提取物和包含得自植物细胞的重组TF的人工囊泡。EP 19359021描述组织因子在昆虫细胞中的表达以及含有在昆虫细胞中表达的重组TF的再脂质化的TF。然而，本领域存在关于基于TF的另外的促凝剂制备物的需要。专利技术概述在第一个方面，本专利技术涉及用于制备具有促凝活性的荷有TF的微囊泡的方法，其包括(i)在真核细胞中表达具有促凝活性的TF或其变体，(ii)从步骤(i)的细胞中回收荷有TF的微囊泡，和(iii)在足以将所述磷脂掺入所述囊泡内的条件下，使步骤(ii)中获得的囊泡与负电荷磷脂接触。在第二个方面，本专利技术涉及用于制备具有促凝活性的荷有TF的微囊泡的方法，其包括( i )提供得自真核细胞的脂质微囊泡，(ii)在足以将所述TF蛋白质或其变体掺入所述微囊泡内的条件下，使具有促凝活性的TF蛋白质或其变体与如(i)中定义的脂质微囊泡接触，和(iii)在足以将所述磷脂掺入所述囊泡内的条件下，使步骤(i i )中获得的囊泡与负电荷磷脂接触，其中步骤(i i )和(i i i )可以以任何次序执行。在另一个方面，本专利技术涉及使用本专利技术的方法获得的荷有TF的微囊泡。在另外一个方面，本专利技术涉及包含本专利技术的荷有TF的微囊泡和药学可接受的媒介物的药物组合物。在另一个方面，本专利技术涉及包含下述的药物组合物，(i)通过包括下述步骤的方法获得的微囊泡a)在真核细胞中表达具有促凝活性的TF或其功能等价变体，和b)从步骤(a)的细胞中回收荷有TF的微囊泡，(ii)至少凝血促进剂,和(iii)药学有效的媒介物。在另一个方面，本专利技术涉及用于用作药物的本专利技术的荷有TF的微囊泡或本专利技术的药物组合物。在另一个方面，本专利技术涉及用于在治疗出血中使用、用于促进伤口愈合或用于治疗血管生成相关疾病的本专利技术的荷有TF的微囊泡或本专利技术的药物组合物。在另一个方面，本专利技术涉及本专利技术的荷有TF的微囊泡用于测定样品中的凝血酶原时间的用途。在另一个方面，本专利技术涉及用于测定抗凝治疗因子的试剂盒，其包含本专利技术的微囊泡。附图简述图I通过TT-173提取物的rTF表达。来自四次独立切向流过滤的纯化TT-173(MFR O. I)的提取物的蛋白质印迹分析。使印迹与人纯化的小鼠抗体(BD BiosciencesPharmingen)反应。以kDa表示的分子量标记显示于该图的左侧。图2.在与PS —起温育后TT-173的促凝活性。A.-为了测试PS对TT-173生物活性的作用，将PS (O. ImM)加入TT-173 (ImL)中，并且在实验过程中将混合溶液维持在R/To在该图表不的不同时间点，将混合物的一个等分试样(10μ I)加入含有130μ1正常贫血小板血浆的加温比色杯中。立即加入20 μ I氯化钙(100禮)，并且借助于凝血计(Stago)测定凝血时间(以秒表示)。实验在300秒后停止(来自5个供体的合并血浆)。B.-如A中所述获得的结果也表示为单位/mL。I个单位定义为在标准凝血测量测定法(130 μ I血浆、20 μ I氯化钙(IOOmM)和10 μ I产物)中在30秒内使正常合并血浆凝固所需的ΤΤ-173量。图3.在与不同浓度的PS—起温育后，ΤΤ-173或脂质化rTF的促凝活性。为了测试PS对TT-173或再脂质化的rTF生物活性的作用，将PS (以该图中指示的浓度)加入TT-173 (ImL)或再脂质化的rTF中。两种混合溶液都在R/T维持2小时。在这个时间后，将每种混合物的一个等分试样(10 μ L)加入含有130 μ I正常贫血小板血浆的加温比色杯中。之后立即加入20 μ I氯化钙(lOOmM)，并且借助于凝血计(Stago)测定凝血时间(以秒表示)。实验在300秒后停止(来自5个供体的合并血浆)。获得的结果表示为单位/mL。 图4.当嵌入合适的磷脂囊泡内时，rTF的促凝活性。根据由Mimms等人(Biochemistry 20,833. 1981)描述的标准化方法,将商业纯化的rTF再脂质化到含有磷脂酰胆碱/磷脂酰丝氨酸(PC/PS)的囊泡内。简言之,使IOOng rTF (American DiagnosticaInc. Stanford, CT, USA)与下述一起温育:以所示 PC:PS 比例(100:0、95: 5、90:10、80:20、70:30) (2. 6mM 终浓度)的 PC/PS (Sigma Aldrich Inc, SaintLouis, MO, USA)，和去污剂(N-辛基-β -D-卩比喃半乳糖苷(galactopiranoside),40mM终浓度)。将混合物勻衆本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·缪拉莫雷诺，J·R·罗德里格斯费尔南德斯阿尔巴，
申请(专利权)人：斯洛柏塔盖茲欧洲有限公司，
类型：
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。