一种基于固定化钛离子亲和材料的磷脂富集方法技术

本发明专利技术公开了一种油脂中磷脂的富集方法。该方法利用固定化钛离子亲和材料与磷脂间的特异性吸附，从而对有油脂样品中磷脂进行富集分离。与传统方法相比，固定化钛离子亲和色谱技术具有操作简单、快速、高效富集、高回收率等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及油脂纯化
，具体说一种油脂中磷脂的富集方法。技术背景磷脂，是生命的物质基础，细胞膜由30%左右的磷脂构成。磷脂是由卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺等组成，且磷脂富含多不饱和脂肪酸。这些磷脂分别对人体的各部位和各器官起着相应的功能。磷脂对活化细胞，维持新陈代谢，基础代谢及荷尔蒙的均衡分泌，增强人体的免疫力和再生力，都能发挥重大的作用。天然油脂中磷脂含量较低，大豆中磷脂含量1.0% _3.2%，南极磷虾中磷脂含量约为1%左右，粗虾油中含磷脂在30%左右。在对磷脂进行分析检测时，易受高含量甘油三脂及色素的影响。因此磷脂的富集分离对于磷脂的检测及样品中磷脂含量的提高具有实际意义。目前对磷脂的分离主要采用色谱柱层析方法或不同极性溶剂的萃取分离。前者一般采用硅胶作为分离材料利用不同脂类间的极性的差异，对其中的磷脂进行分离，由于样品中其它脂溶性物质及色素的干扰，需要对分离方法进行摸索，方法复杂。后者利用溶剂萃取的方法难于达到磷脂含量的大幅提高。刘代成等对南极磷虾虾油中的磷脂利用溶剂萃取富集，磷脂含量仅有30%提高至40%左右(刘代成，王欣，张潇予.从南极磷虾中提取高磷脂含量的虾油的方法.申请号201110022395.1)。Zhao等报告了固定化钛离子亲和材料的合成及材料中Ti4+能够以P-O键特异性吸附在磷酸肽的富集中的应用(Houjiang Zhao, Mingliang Ye, Jing Dong et al., Robustphosphoproteome enrichment using monodisperse microsphere-based immobilizedtitanium(IV) 1n affinity chromatography.Nature protocols, 20138 (3)，461-480.)。本方法利用此材料与油脂中的磷脂的特异性吸附，对油脂样品中的磷脂进行富集，而不受油脂中甘油三脂的影响。因此富集率高，杂质干扰少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种适用于油脂中磷脂富集的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案内容为:利用固定化钛离子亲和材料对油脂中的磷脂进行吸附脱除；具体步骤为:(I)富集:含磷脂油脂溶解于甲醇或氯仿-甲醇溶液中，将吸附材料与磷脂样品20:0.3-3混合，震荡20-40min,离心>12000rpm,离心5min,收集上清。(2)洗非特异性吸附:向步骤I离心后的材料中加入甲醇-水溶液，重悬材料，震荡5-10min,离心>12000rpm,离心5min,收集上清。(3)洗脱:向步骤2离心后的材料加入I % -10%浓氨水-甲醇溶液(浓氨水为氨质量含量为25-28%的水溶液)，重悬材料，震荡20-40min，离心>12000rpm，离心5min，收集上清，获得富集磷脂样品，甲酸调节PH至中性。(4)将收集的样品利用HPLC进行检测，以表征富集过程材料对磷脂的吸附量、吸附非磷脂类的干扰及磷脂洗脱回收率。色谱条件:HPLC: Agi lent 1100色谱柱:D10L(150X4.6mm, 5μπι)流动相:Α:水(2.5mM甲酸铵-甲酸pH = 3.0)B:乙臆-水(95:5 v/v, 2.5mM 甲酸铵-甲酸 pH = 3.0)检测器:蒸发光散射检测器(ELSD)洗脱梯度:0-20min100% B-80% B。所述固定化钛离子亲和材料的合成参考Zhao等文献(Houjiang Zhao, MingliangYe, Jing Dong et al., Robust phosphoproteome enrichment using monodispersemicrosphere-based immobilized titanium (IV) 1n affinity chromatography.Natureprotocols, 20138(3), 461-480.)。本专利技术与现有技术相比具有如下优点:1.相比于色谱柱分离方法，本方法操作简单，富集周期较短。只需混合震荡器和离心机，无需其它设备，操作从吸附、清洗到洗脱整个过程在2-3h内完成。2.相比于溶剂萃取方法，本方法对磷脂特异性吸附，富集效率高，无杂质干扰。【附图说明】图1 HPLC测定的固定化钛离子亲和材料对南极磷虾油中磷脂酰胆碱的富集-洗脱过程中样品色谱图；图2 HPLC测定的固定化钛离子亲和材料对混合脂质样品的富集_洗脱过程中样品色谱图。【具体实施方式】:下面通过具体实施例对本专利技术的方法和结果进行说明。实施例1南极磷虾中富含磷脂酰胆碱(PC)即卵磷脂，同时含有以甘油三酯(TAG)为主的低极性脂。利用本方法对南极磷虾油中卵磷脂进行富集。(I)富集:含磷脂的南极磷虾提取油脂15mg溶解于5mL甲醇中，得南极磷虾油脂样品5mL,取固定化钛离子亲和吸附材料20mg与南极磷好油脂样品ImL混合,震荡30min,离心12000rpm,离心5min,收集上清。(2)洗非特异性吸附:向步骤I离心后的沉淀材料中加入甲醇-水(80:20 v/V) ImL,重悬材料,震荡5min,离心12000rpm,离心5min,收集上清。(3)洗脱:向步骤2离心后的沉淀材料加入体积含量2.5%浓氨水-甲醇溶液ImL (浓氨水为氨质量含量为25-28%的水溶液)，重悬材料，震荡40min，离心12000rpm，离心5min,收集上清，甲酸调节pH至中性。(4)将收集的样品利用HPLC进行检测，色谱条件:HPLC:Agi lent 1100色谱柱:D10L(150X4.6臟，δμπι)流动相:A:水(2.5mM甲酸铵-甲酸pH = 3.0)B:乙臆-水(95:5 v/v, 2.5mM 甲酸铵-甲酸 pH = 3.0)检测器:蒸发光散射检测器(ELSD)洗脱梯度:0-20min100% B-80% B。在上述色谱条件下，磷脂酰胆碱PC的保留时间为15.6min检测结果:原始样品检测色谱图见图la，ImL样品中PC质量为1.197mg,南极磷虾提取油脂中PC含量为39.9%。富集处理后样品色谱图为图lb，洗非特异性吸附处理后样品色谱图为图lc，测定结果显示样品经富集处理后，残留样品量较少。洗脱处理后样品色谱图为图1d,洗脱后基本无低极性脂的干扰，回收磷脂PC为1.103mg,回收率为92%。实施例2混合甘油三脂(TAG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)四种脂质作为样品进行试验，考察本方法对磷脂PG、PE、PC的富集作用。(I)富集:去混合 TAG、PG、PE、PC 样品 0.80mg、0.35mg、0.41mg、0.45mg 分别溶解于氯仿-甲醇(I: I v/v) ImL,得油脂样品ImL,取固定化钛离子亲和吸附材料20mg与混合脂质样品ImL混合,震荡30min,离心12000rpm,离心5min,收集上清。(2)洗非特异性吸附:向步骤I离心后的材料中加入甲醇-水(80:20 v/v) lmL，重悬材料，震荡5min,离心12000rpm,离心5min,收集上清。(3)洗脱:向步骤2离心后的沉淀材料加入体积含量2.5 %浓氨水-甲醇溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于固定化钛离子亲和材料的磷脂富集方法，其特征在于：利用固定化钛离子亲和材料对油脂中的磷脂进行吸附脱除；具体步骤为：(1)富集：含有磷脂的油脂样品溶解于上样溶剂中，将吸附材料与磷脂样品混合，震荡20‑40min，离心收集上清；(2)洗非特异性吸附：向步骤(1)离心后的沉淀材料中加入洗非特异性吸附溶剂，重悬材料，震荡5‑10min，离心收集上清；(3)洗脱：向步骤(2)离心后的沉淀材料加入洗脱溶剂，震荡20‑40min，离心收集上清，获得富集磷脂样品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：薛松，孟迎迎，曹旭鹏，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21