凝血因子IX组合物及其制备和使用方法技术

本发明专利技术涉及包含与延伸重组多肽(XTEN)连接的因子DC凝血因子的组合物、编码所述组合物的分离的核酸和含有所述分离的核酸的载体和宿主细胞，以及制备所述组合物的方法和使用所述组合物治疗凝血因子相关的疾病、疾患和病症的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】凝血因子IX组合物及其制备和使用方法关于联邦资助研究的声明本专利技术在由美国国立卫生研究院授予的SBIR基金2R44GM079873-02的政府支持下完成。政府具有本专利技术的某些权利。相关申请的交叉引用本申请要求2009年8月24日提交的美国临时申请No. 61/236，493 ;2009年8月25日提交的美国临时申请No.61/236，836，2009年11月10日提交的美国临时申请No. 61/280，955，2009年11月10日提交的美国临时申请No. 61/280，956，以及2010年2 月3日提交的美国申请No. 12/699，761的优先权权益，所有这些申请，以及在代理人案号32808-719. 201下随同提交的共同待决的申请，为了所有目的其全部内容以引用的方式并入本文。
技术介绍
在血友病中，凝血受到缺乏某些血浆凝血因子的干扰。人因子IX(FIX)是一种丝氨酸蛋白酶的酶原，它是凝血级联的内源性途径的一个重要组分。在没有FIX缺乏的个体中，FIX的平均半衰期很短，约为18-24小时。在大约1/30000男性中发生的X-连锁疾病引起的功能FIX缺陷导致血友病B，也称为Christmas病，是以一位被发现缺乏该因子的叫做St印hen Christmas的年轻男孩命名的。已经记载了超过100个因子IX的突变；其中一些不引起症状，但许多导致明显的出血性疾病。如果不及时治疗，血友病B与损伤后无法控制的肌肉、关节和体腔内的出血有关，并可能导致死亡。此前，该疾病的治疗包括施用由来自供体库的人血浆制备的FIX，这具有随之而来的感染血源性病毒的风险，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)。最近，重组FIX产品已经市售。外来提供的因子IX的体内活性受到蛋白质半衰期和凝血抑制剂(包括抗凝血酶III)的限制。因子IX组合物通常有短半衰期，这需要经常注射。此外，目前的基于FIX的疗法由于较差的生物利用度，需要静脉内施用。因此，需要当作为血友病(包括血友病B)的预防和/或治疗方案的一部分施用时具有延长的半衰期和保留活性的因子IX组合物。因子VII是在肝脏中合成且作为具有约50kDa的分子量的单链酶原分泌入血中的凝血因子蛋白。FVII酶原通过蛋白水解性裂解被转化成活化形式(FVIIa)，并且该活性形式当与组织因子(TF)络合时能够将因子IX和因子X转化成它们的活性形式，导致快速凝血酶产生和血纤蛋白形成。因为rFVIIa的循环半衰期约2. 3小时(“Summary Basis forApproval for NovoSeven ”，FDA参考号96-0597)，所以对于血友病受试者和具有因子VII缺陷的受试者的出血病症的治疗，需要多次施用和频繁施用。对治疗蛋白的化学修饰可以降低其体内清除率并随后增加血清半衰期。常见修饰的一个实例是添加聚乙二醇(PEG)部分，聚乙二醇(PEG)部分通常通过PEG上与胺基(例如赖氨酸侧链或N端)反应的醛或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团而与蛋白质偶联。然而，偶联步骤可导致需要分离的不均一产物混合物的形成，导致明显的产物损失和生产复杂性，并且得不到化学上完全均一的产物。而且，如果治疗蛋白结合位点附近的氨基酸侧链被PEG化过程所修饰，那么治疗蛋白的药理学功能可能受阻。Fe结构域与治疗蛋白的融合是增加治疗蛋白大小，因此降低通过肾的清除率的另一种方法。此外，Fe结构域赋予结合溶酶体并通过FcRn受体从溶酶体再循环的能力，这导致增加的药代动力学半衰期。不幸的是，Fe结构域未能在重组表达期间有效折叠，并易于形成被称为包涵体的不溶性沉淀。这些包涵体必须被溶解并且功能性蛋白质必须从错误折叠的聚集物复性，这种过程是耗时、低效且昂贵的。因此，依然需要具有增加半衰期的改善的凝血因子组合物，其能够以较低频率施用，和/或通过更简单的过程以更低成本生产。专利技术概述本专利技术涉及用于治疗或改善病症或增强与施用凝血因子IX和/或VII相关的参数的组合物和方法。具体地，本专利技术提供了包含一种或多种延伸重组多肽(XTEN)的融合蛋白的组合物。主题XTEN通常为非重复序列和非结构化构象。XTEN与选自因子IX (“FIX”)、因子VII( “FVII”)、因子VII-因子IX杂种和其序列变体的凝血因子(“CF”)连接，形成凝血因子-XTEN融合蛋白(“CFXTEN”)。在某种程度上，本公开涉及包含融合蛋白的药物组合物及其用于治疗凝血因子相关的疾病、病症或疾患。CFXTEN组合物与未连接XTEN的 CF相比具有增强的药代动力学性质，其可允许更便利的给药和改善的药效。在一些实施方案中，本专利技术的CFXTEN组合物不具有选自以下的组分聚乙二醇(PEG)、白蛋白、抗体和抗体片段。在一些实施方案中，本专利技术提供了分离的因子IX融合蛋白，其包含与选自表I的氨基酸序列具有至少约90 %、或约95 %、或约96 %、或约97 %、或约98 %、或约99 %同一性的因子IX序列。具有这种序列同一性的因子IX进一步与具有至少约100至约3000个氨基酸残基的延伸重组多肽(XTEN)连接。在一个实施方案中，XTEN与FIX或FVII CF的C-端连接。在一些实施方案中，本专利技术提供了分离的因子VII融合蛋白，其包含与选自表2的氨基酸序列具有至少约90 %、或约95 %、或约96 %、或约97 %、或约98 %、或约99 %同一性的因子VII。具有这种序列的因子VII与延伸重组多肽(XTEN)连接。具有连接单个XTEN的单个FIX或单个FVII的CFXTEN的非限制性实例示于表41中。在一个实施方案中，本专利技术提供了与来自表41的CFXTEN相比具有至少约80%序列同一性，或者与来自表41的CFXTEN相比具有至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或约 100%序列同一性的CFXTEN组合物。在一些实施方案中，融合蛋白的CF和XTEN组分经由可通过蛋白酶(包括内源性哺乳动物蛋白酶)裂解的裂解序列连接。这类蛋白酶的实例包括但不限于FXIa、FXIIa、激肽释放酶、FVIIa、FIXa, FXa、凝血酶、弹性蛋白酶_2、粒酶B、MMP-12、MMP-13、MMP-17或MMP-20、TEV、肠激酶、鼻病毒3C蛋白酶和分选酶A，或选自表7的序列。在一个实施方案中，具有裂解序列的CFXTEN组合物与来自表42的CFXTEN相比具有至少约80%序列同一性的序列，或者与来自表42的CFXTEN相比具有至少约81%、82%、83%、84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99 %，或约100 %序列同一性。然而，本专利技术还提供了用表I或表2的任一个CF序列替换表42的序列中的CF，以及用表4的任一个XTEN序列替换表42的序列中的XTEN，以及用表7的任何裂解序列替换表42的序列中的裂解序列。在具有裂解序列的CFXTEN实施方案中，通过蛋白酶从CF释放XTEN而裂解该裂解序列。在前述的一些实施方案中，一旦CF组分通过裂解序列的裂解而从XTEN释放，它就会变得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·舍伦贝格尔，J·西尔维尔曼，W·P·斯特默，CW·王，B·斯平克，N·C·吉特欣格，W·托，
申请(专利权)人：阿穆尼克斯运营公司，
类型：发明
国别省市：