靶向XTEN缀合物组合物及其制备方法技术

本发明专利技术提供了药物缀合物组合物以及用于制备和使用该组合物的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明专利技术涉及靶向缀合物组合物，其包含与靶向部分连接的含半胱氨酸的结构域(CCD)、延伸的重组多肽(XTEN)和肽可切割部分，并具有与半胱氨酸残基交联的药理活性有效负载药物，从而导致组合物可被与靶组织相关的蛋白酶切割。本发明专利技术还提供了制备该靶向缀合物组合物的方法以及使用该靶向缀合物组合物的方法。

Targeted XTEN conjugate composition and process for producing the same

The present invention provides a pharmaceutical conjugate composition and a composition and a method for preparing and using the same. In some embodiments, the present invention relates to conjugates targeting compositions comprising the cysteine containing domain is connected with a targeting moiety (CCD), the extension of the recombinant polypeptide (XTEN) and peptide cutting part, and has the pharmacological activity and cysteine residues cross-linked payload drugs, resulting in composition can be and the target tissue related protease cleavage. The present invention also provides a process for preparing the target conjugate composition and a method of using the targeted conjugate composition.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向XTEN缀合物组合物及其制备方法交叉引用本申请要求于2014年11月11日提交的美国临时申请号62/078,171、于2015年2月23日提交的美国临时申请号62/119,483；以及于2015年8月28日提交的美国临时申请号62/211,378的权益；所有这些申请均通过引用并入本文。本申请涉及于2015年11月11日提交的美国临时申请号62/254,076，该申请通过引用并入本文。
技术介绍
许多经批准的癌症治疗法为杀死正常细胞以及肿瘤细胞的细胞毒性药物。这些细胞毒性药物的治疗益处在很大程度上取决于肿瘤细胞比正常细胞更敏感，从而允许使用不导致不可接受的副作用的剂量达到临床反应。然而，基本上所有这些非特异性药物都对正常组织造成一些损害，这往往限制了治疗。与抗体或其他结合细胞配体的分子连接的细胞毒性药物(通常以首字母缩写“ADC”(抗体-药物缀合物)命名)的使用意在通过将细胞毒性药物选择性递送给癌细胞来进一步提高治疗指数(或治疗窗)。虽然ADC提供了很大希望，但经批准的药物的数目仍然很少，它们的制备复杂且昂贵(鼠单克隆的人源化以及使这样的抗体人源化通常所需的大量突变)，并且许多的药代动力学是不充分的；例如，ADC中抗体片段诸如scFv的使用。另外，基于抗体的ADC的大小是关于这样的组合物穿透实体瘤或带有癌细胞的组织和器官的能力的限制。延长治疗剂(无论是治疗性蛋白、肽还是小分子)的半衰期，往往需要专门的制剂或对治疗剂自身的修饰。常规的修饰方法如聚乙二醇化、向治疗剂添加抗体片段或白蛋白分子，具有多个严重缺陷。虽然这些修饰形式可大规模制备，但这些常规方法通常受到商品成本高、生产过程复杂以及最终产品纯度低的困扰。往往，即使并非不可能，也很难纯化到靶标实体的均质性。这对于聚乙二醇化尤为明显，其中反应本身不能精确控制以生成携带相同数目或质量的聚乙二醇的聚乙二醇化药剂的同质群体。此外，这些聚乙二醇化药剂的代谢物可能具有严重的副作用。例如，已在动物模型中观察到聚乙二醇化蛋白引起肾小管空泡形成(Bendele,A.,Seely,J.,Richey,C.,Sennello,G.&Shopp,G.Shortcommunication:renaltubularvacuolationinanimalstreatedwithpolyethylene-glycol-conjugatedproteins.Toxicol.Sci.1998.42,152–157)。肾清除的聚乙二醇化蛋白或它们的代谢物可在肾中积累，导致干扰正常肾小球过滤的PEG水合物的形成。另外，可诱导动物和人类产生针对PEG的抗体(Sroda,K.等人RepeatedinjectionsofPEG-PEliposomesgenerateanti-PEGantibodies.Cell.Mol.Biol.Lett.2005.10,37-47)。因此，对于可穿透和/或贴附于肿瘤或癌性组织并向癌细胞递送细胞毒性化合物，并且具有足够半衰期和增强的选择性使得总治疗指数提高的抗癌剂仍有相当大的需求。
技术实现思路
在一些方面，本专利技术公开了靶向缀合物组合物，其包含一个或多个延伸的重组多肽序列(XTEN)、一个或多个肽切割部分(PCM)、一个或多个靶向部分(TM)以及一个或多个有效负载药物分子，其中当该缀合物组合物暴露于蛋白酶时，PCM能够被切割。本专利技术还涉及在疾病治疗中使用所公开的缀合物组合物的治疗方法。本文公开的组合物和方法不仅作为治疗法有用，而且作为用于候选治疗剂的临床前和临床开发的研究工具也特别有用。在一些方面，本专利技术部分地通过生成具有有效负载肽、蛋白质和小分子以及靶向携带某些配体的组织的靶向部分，以及具有当接近靶组织或靶细胞时能够被蛋白酶所切割的肽基切割部分的靶向部分的靶向缀合物组合物，满足了这一需求。与未缀合的产物相比，靶向缀合物组合物在一个或多个方面较优越，包括增强的终末半衰期、靶向递送以及对健康组织降低的毒性。特别地考虑到，可切割的缀合物组合物实施方案可表现出本文所公开的性质的一种或多种或任意组合。进一步特别地考虑到，治疗方法可表现出本文所公开的性质的一种或多种或任意组合。在一个方面，本专利技术提供了一种含有半胱氨酸的结构域(CCD)。在一些实施方案中，所述CCD包含至少6个氨基酸残基，其中所述结构域的特征在于：(a)其具有至少一个半胱氨酸残基；(b)其具有至少一个非半胱氨酸残基，并且至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或100％的非半胱氨酸残基选自3至6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸；(c)没有三个连续的氨基酸是相同的，除非所述氨基酸为半胱氨酸或丝氨酸；以及(d)谷氨酸残基不与半胱氨酸残基相邻。在一些实施方案中，所述CCD具有6至约144个氨基酸残基以及1至约10个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述CCD包含至少两个半胱氨酸残基，并且任何两个相邻的半胱氨酸被不多于15个非半胱氨酸氨基酸残基隔开。在一些实施方案中，至少一个半胱氨酸残基位于距所述CCD的N末端或C末端9个氨基酸残基之内。在一些实施方案中，所述CCD序列与选自表6中所示序列的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同。在一个方面，本专利技术提供了一种包含本文公开的任意CCD的融合蛋白。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含与延伸的重组多肽(XTEN)融合的CCD，其中所述XTEN的特征在于：(a)其具有比所述CCD的分子量大至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍、或至少30倍的分子量；(b)其具有100至约1200个氨基酸，其中至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或100％的氨基酸残基选自4至6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸；(c)其基本上是非重复的，以致于(1)XTEN序列不含三个连续的相同氨基酸，除非所述氨基酸为丝氨酸；(2)至少90％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，所述非重叠序列基序中的每一个均包含12个氨基酸残基，其中任意两个连续的氨基酸残基在每个序列基序中出现不超过两次；或(3)所述XTEN序列具有小于3的平均子序列得分；(d)其具有如通过GOR算法所确定的大于90％的无规卷曲形成；(e)其具有如通过Chou-Fasman算法所确定的少于2％的α-螺旋和2％的β-折叠；以及(f)当通过TEPITOPE算法分析时，其缺乏预测的T细胞表位，其中针对所述XTEN序列中表位的TEPITOPE算法预测是基于-9的阈值得分。在一些实施方案中，所述序列基序选自表9中所示的序列。在一些实施方案中，所述XTEN与选自表10或表11中所示序列的序列具有至少90％的序列同一性或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有半胱氨酸的结构域(CCD)，所述结构域包含至少6个氨基酸残基，其中所述结构域的特征在于：a.其具有至少一个半胱氨酸残基；b.其具有至少一个非半胱氨酸残基，并且至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％的非半胱氨酸残基选自3至6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸；c.没有三个连续的氨基酸是相同的，除非所述氨基酸为半胱氨酸或丝氨酸；以及(d)谷氨酸残基不与半胱氨酸残基相邻。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.11 US 62/078,171;2015.02.23 US 62/119,483;1.一种含有半胱氨酸的结构域(CCD)，所述结构域包含至少6个氨基酸残基，其中所述结构域的特征在于：a.其具有至少一个半胱氨酸残基；b.其具有至少一个非半胱氨酸残基，并且至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％的非半胱氨酸残基选自3至6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸；c.没有三个连续的氨基酸是相同的，除非所述氨基酸为半胱氨酸或丝氨酸；以及(d)谷氨酸残基不与半胱氨酸残基相邻。2.根据权利要求1所述的CCD，其中所述CCD具有6至约144个氨基酸残基以及1至约10个半胱氨酸残基。3.根据权利要求1或2所述的CCD，其中至少一个半胱氨酸残基位于距所述CCD的N末端或C末端9个氨基酸残基之内。4.根据前述权利要求中任一项所述的CCD，其中所述CCD序列与选自表6中所示序列的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同。5.一种包含前述权利要求中任一项所述的CCD的融合蛋白，其中所述CCD与延伸的重组多肽(XTEN)融合，其中所述XTEN的特征在于：a.其具有比所述CCD的分子量大至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍、至少20倍或至少30倍的分子量；b.其具有100至约1200个氨基酸，其中至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或100％的氨基酸残基选自4至6种选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸；c.其基本上是非重复的，以致于(1)XTEN序列不含三个连续的相同氨基酸，除非所述氨基酸为丝氨酸；(2)至少90％的XTEN序列由非重叠序列基序组成，所述非重叠序列基序中的每一个包含12个氨基酸残基，其中任意两个连续的氨基酸残基在每个序列基序中出现不超过两次；或(3)所述XTEN序列具有小于3的平均子序列得分；d.其具有如通过GOR算法所确定的大于90％的无规卷曲形成；e.其具有如通过Chou-Fasman算法所确定的少于2％的α-螺旋和2％的β-折叠；以及f.当通过TEPITOPE算法分析时，其缺乏预测的T细胞表位，其中针对所述XTEN序列中表位的TEPITOPE算法预测是基于-9的阈值得分。6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述序列基序选自表9中所示的序列。7.根据权利要求5或权利要求6所述的融合蛋白，其中所述XTEN与选自表10或表11中所示序列的序列具有至少90％的序列同一性或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％的序列同一性或与之相同。8.根据权利要求5-7中任一项所述的融合蛋白，其进一步包含至少第一靶向部分(TM)，其中所述靶向部分能够特异性结合与靶组织相关的配体。9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述TM与所述CCD的N末端或C末端连接。10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白从N末端至C末端配置为：a.(TM)-(CCD)-(XTEN)；或b.(XTEN)-(CCD)-(TM)。11.根据权利要求9或权利要求10所述的融合蛋白，其中所述TM与所述CCD重组地融合。12.根据权利要求9或权利要求10所述的融合蛋白，其中所述TM使用选自表12中所示序列的连接体序列与所述CCD缀合。13.根据权利要求8-12中任一项所述的融合蛋白，其中所述靶组织的配体与肿瘤、癌细胞或具有炎症状况的组织相关。14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其进一步包含一个或多个药物或生物活性蛋白质，其中每个药物或生物活性蛋白质与所述CCD的半胱氨酸残基的巯基基团缀合。15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述靶组织为肿瘤或癌细胞，并且所述药物为选自表14和表15中的药物的细胞毒性药物。16.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述靶组织为肿瘤或癌细胞，并且所述药物为选自下组的细胞毒性药物：多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂(PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶和假单胞菌外毒素A。17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述药物为单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。18.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述药物为单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。19.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述药物为吗他汀(DM1)。20.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述靶组织为肿瘤或癌细胞，并且所述生物活性蛋白质选自TNFα、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素。21.根据权利要求8-20中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少第一TM选自IgG抗体、Fab片段、F(ab)2片段、scFv、scFab、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。22.根据权利要求21所述的融合蛋白，其中所述至少第一靶向部分为scFv。23.根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述scFv包含单克隆抗体的VL和VH序列，其中每个VL和VH与选自表19中所示的VL和VH序列的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间。24.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述scFv从N末端至C末端被配置为VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。25.根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述scFv包含重链CDR区段HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链CDR区段LCDR1、LCDR2、LCDR3，以及来自选自表19中所示抗体的抗体的构架区(FR)，其中所述重链CDR和FR以FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且所述轻链CDR和FR以FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且进一步包含将所述轻链区段与所述重链区段融合的选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述scFv从N末端至C末端被配置为VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。26.根据权利要求22-25中任一项所述的融合蛋白，其包含第二scFv，其中所述第二scFv与所述第一scFv相同，并且所述第一和第二scFv通过选自SGGGGS、GGGGS、GGS和GSP的连接体串联地重组融合，其中所述scFv与所述CCD的N末端或C末端重组地融合。27.根据权利要求22-25中任一项所述的融合蛋白，其包含第二scFv，其中所述第二scFv能够特异性结合与所述靶组织相关的第二配体，其中(i)所述第二配体不同于所述第一scFv结合的配体，(ii)所述第一和第二scFv通过选自SGGGGS、GGGGS、GGS和GSP的连接体串联地重组融合，并且(iii)所述scFv与所述CCD的N末端或C末端重组地融合。28.根据权利要求27所述的融合蛋白，其中所述第二scFv包含单克隆抗体的VL和VH序列，其中每个VL和VH与选自表19中所示的VL和VH序列的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间。29.根据权利要求27所述的融合蛋白，其中所述第二scFv从N末端至C末端被配置为VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。30.根据权利要求28所述的融合蛋白，其中所述第二scFv包含重链CDR区段HCDR1、HCDR2、HCDR3，轻链CDR区段LCDR1、LCDR2、LCDR3，以及来自选自表20中所示抗体的抗体的相关构架区(FR)，其中所述重链CDR和FR区段以FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且所述轻链CDR和FR区段以FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4的顺序融合在一起，并且进一步包含将所述轻链区段与所述重链区段融合的选自表20中所示序列的连接体序列。31.根据权利要求8-20中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少第一TM选自叶酸、促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂、天冬氨酰胺酰甘氨酰精氨酸(NGR)和精氨酰甘氨酰天冬氨酸(RGD)。32.根据权利要求8-20所述的融合蛋白，其中所述至少第一TM是非蛋白质的。33.根据权利要求31所述的融合蛋白，其中所述至少第一TM为叶酸。34.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中a.所述靶组织具有炎症状况；b.所述药物选自地塞米松、吲哚美辛、泼尼松龙、二丙酸倍他米松、丙酸氯倍他索、醋酸氟轻松、氟氢缩松、卤倍他索丙酸酯、双醋酸双氟拉松和去羟米松；并且c.所述靶向部分为来源于能够特异性结合选自TNF、IL-1受体、IL-6受体、α4整联蛋白亚基、CD20和IL-21受体的配体的单克隆抗体的scFv。35.根据权利要求34所述的融合蛋白，其中所述scFv包含单克隆抗体的VL和VH序列，其中每个VL和VH与选自表19中所示的VL和VH序列的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间。36.根据权利要求5-35中任一项所述的融合蛋白，其进一步包含肽切割部分(PCM)，其中所述PCM能够被一种、两种或更多种哺乳动物蛋白酶所切割。37.根据权利要求8-36中任一项所述的融合蛋白，其进一步包含肽切割部分(PCM)，其中所述PCM能够被一种、两种或更多种哺乳动物蛋白酶所切割，并且其中所述融合蛋白从N末端至C末端被配置为：a.(TM)-(CCD)-(PCM)-(XTEN)；b.(XTEN)-(PCM)-(CCD)-(TM)；c.(XTEN)-(PCM)-(TM)-(CCD)；或d.(CCD)-(TM)-(PCM)-(XTEN)。38.根据权利要求36或权利要求37所述的融合蛋白，其进一步包含与所述第一XTEN相同的第二XTEN，其中所述第一和第二XTEN均使用三聚体交联体与所述PCM的N末端或C末端缀合。39.根据权利要求36-38中任一项所述的融合蛋白，其中所述PCM包含与选自表8中所示序列的序列具有至少90％的序列同一性或与之相同的肽序列。40.根据权利要求36-39中任一项所述的融合蛋白，其中所述哺乳动物蛋白酶与所述靶组织共定位。41.根据权利要求40所述的融合蛋白，其中所述哺乳动物蛋白酶为所述靶组织分泌的细胞外蛋白酶，或为肿瘤细胞外基质的组分。42.根据权利要求36-41中任一项所述的融合蛋白，其中所述哺乳动物蛋白酶选自表7中所示的蛋白酶。43.根据权利要求36-41中任一项所述的融合蛋白，其中所述哺乳动物蛋白酶选自跨膜肽酶、中性溶酶(CD10)、PSMA、BMP-1、ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17(TACE)、ADAM19、ADAM28(MDC-L)、具有血小板反应蛋白基序的ADAM(ADAMTS)、ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、MMP-1(胶原酶1)、MMP-2(明胶酶A)、MMP-3(溶基质蛋白酶1)、MMP-7(基质溶解素1)、MMP-8(胶原酶2)、MMP-9(明胶酶B)、MMP-10(溶基质蛋白酶2)、MMP-11(溶基质蛋白酶3)、MMP-12(巨噬细胞弹性蛋白酶)、MMP-13(胶原酶3)、MMP-14(MT1-MMP)、MMP-15(MT2-MMP)、MMP-19、MMP-23(CA-MMP)、MMP-24(MT5-MMP)、MMP-26(基质溶解素2)、MMP-27(CMMP)、豆荚蛋白、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L、组织蛋白酶S、组织蛋白酶X、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、分泌酶、尿激酶(uPA)、组织型血纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA)、纤溶酶、凝血酶、前列腺特异性抗原(PSA、KLK3)、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)、弹性蛋白酶、类胰蛋白酶、II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)、DESC1、hepsin(HPN)、蛋白裂解酶、蛋白裂解酶-2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4(CAP2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、激肽释放酶相关肽酶(KLK家族)、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13和KLK14。44.根据权利要求14-43中任一项所述的融合蛋白，其中在药物分子与所述融合蛋白的CCD的半胱氨酸残基之间进行缀合反应时，获得缀合物产物的异质群体，其中完全缀合的CCD-药物缀合物产物能够达到>6的峰距，其中：a)所述融合蛋白包含具有600个或更多个累积的氨基酸残基的多肽，包括具有3至9个半胱氨酸残基的CCD；b)所述异质缀合物产物具有与所述CCD连接的至少1、2和3个或更多个有效负载的混合物；并且c)在反相HPLC色谱条件下分析所述缀合产物。45.根据权利要求44所述的融合蛋白，其中所述CCD为表6中具有3个半胱氨酸残基的序列，并且所述融合蛋白具有至少800个累积的氨基酸残基。46.根据权利要求44所述的融合蛋白，其中所述CCD为表6中具有9个半胱氨酸残基的序列，并且所述融合蛋白具有至少800个累积的氨基酸残基。47.根据权利要求40-46中任一项所述的融合蛋白，其中在所述PCM被所述靶组织蛋白酶切割时，所述XTEN从所述融合蛋白中释放，其中所述靶向部分和连接有药物或生物活性蛋白质的CCD仍然连接在一起作为释放的靶向组合物。48.根据权利要求47所述的释放的靶向组合物，其中所述释放的靶向组合物的分子量具有比未切割的融合蛋白小至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍的分子量。49.根据权利要求47所述的释放的靶向组合物，其中所述释放的靶向组合物的流体动力学半径比未切割的融合蛋白小至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍。50.根据权利要求47-49中任一项所述的释放的靶向组合物，其中所述释放的靶向组合物对靶组织配体具有与未切割的融合蛋白相比大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或100倍的结合亲和力。51.根据权利要求47-49中任一项所述的释放的靶向组合物，其中所述释放的靶向组合物对所述配体具有小于约10-4M、或小于约10-5M、或小于约10-6M、或小于约10-7M、或小于约10-8M、或小于约10-9M、或小于约10-10M、或小于约10-11M、或小于约10-12M的结合亲和力常数(Kd)。52.根据权利要求50或51所述的释放的靶向组合物，其中在体外ELISA测定中测量所述结合亲和力。53.根据权利要求47-52中任一项所述的释放的靶向组合物，其中在体外哺乳动物细胞的细胞毒性测定中，所述释放的靶向组合物对携带所述配体的靶细胞的细胞毒性比未切割的融合蛋白的细胞毒性大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或100倍，其中通过计算IC50确定细胞毒性。54.根据权利要求47-53中任一项所述的释放的靶向组合物，其中当在可比条件下在暴露于所述释放的靶向组合物或所述融合蛋白后24-72小时之间确定生长抑制时，在体外哺乳动物细胞的细胞毒性测定中，所述释放的靶向组合物对携带所述配体的靶细胞的生长的抑制比未切割的融合蛋白对生长的抑制大至少20％、或至少40％、或至少50％。55.根据权利要求47所述的融合蛋白，其中在向具有携带所述配体的靶组织和能够切割所述PCM的共定位蛋白酶的受试者施用团剂量的治疗有效量的融合蛋白后，通过所述蛋白酶释放的所述释放的靶向组合物能够在所述靶组织中累积到比未切割的融合蛋白大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或100倍的浓度。56.根据权利要求55所述的融合蛋白，其中所述靶组织为肿瘤。57.根据权利要求56所述的融合蛋白，其中在施用后7至21天，所述施用导致所述肿瘤的体积减小至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％。58.根据权利要求56所述的融合蛋白，其中在施用后7-21天，所述施用导致比不包含所述PCM且以可比剂量施用的融合蛋白多至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％的肿瘤体积减小。59.根据权利要求55-58中任一项所述的融合蛋白，其中所述受试者选自小鼠、大鼠、兔、猴和人类。60.一种选自表5中的缀合物的靶向缀合物组合物。61.根据权利要求60所述的靶向缀合物组合物，其中所述组合物从N末端至C末端被配置为：a.(TM)-(CCD)-(PCM)-(XTEN)；或b.(XTEN)-(PCM)-(CCD)-(TM)；其中药物分子与所述CCD的每个半胱氨酸残基连接。62.一种靶向缀合物组合物，其包含(a)表5中的构建体，包含所述构建体的氨基酸序列，或(b)变体构建体，包含与所述构建体的氨基酸序列至少90％相同的变体序列，其中所述构建体具有式I的结构：其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。63.一种靶向缀合物组合物，其包含(a)表5中的构建体，包含所述构建体的氨基酸序列，或(b)变体构建体，包含与所述构建体的氨基酸序列至少90％相同的变体序列，其中所述构建体具有式II的结构：其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。64.一种靶向缀合物组合物，其包含(a)表5中的构建体，包含所述构建体的氨基酸序列，或(b)变体构建体，包含与所述构建体的氨基酸序列至少90％相同的变体序列，其中所述构建体具有式III的结构：其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。65.一种靶向缀合物组合物，其包含(a)表5中的构建体，包含所述构建体的氨基酸序列，或(b)变体构建体，包含与所述构建体的氨基酸序列至少90％相同的变体序列，其中所述构建体具有式IV的结构：其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。66.一种靶向缀合物组合物，其中所述靶向缀合物组合物根据式I的结构进行配置：其中a.所述TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同，并且进一步包含选自表20中所示序列的连接体序列，其中所述连接体重组地融合在所述VL与所述VH之间；b.所述CCD选自表6中的CCD；c.所述XTEN与表10中所示的序列具有至少90％、或91％、或92％、或93％、或94％、或95％、或96％、或97％、或98％、或99％的同一性或与之相同；并且d.所述药物选自多柔比星、奈莫柔比星、PNU-159682、紫杉醇、多西他赛、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、多拉司他汀10、多拉司他汀15、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、美登素、吗他汀(DM1)、美登木素生物碱DM4、加利车霉素、N-乙酰加利车霉素、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、喜树碱、托泊替康、伊立替康、SN-38、倍癌霉素A、倍癌霉素B1、倍癌霉素B2、倍癌霉素C1、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素TM、倍癌霉素MB、倍癌霉素DM、丝裂霉素C、雷查霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、微管蛋白裂解素B、微管蛋白裂解素M、吡咯并苯并二氮杂(PBD)、硼替佐米、hTNF、Il-12、豹蛙酶、hTNF、IL-12、豹蛙酶、人核糖核酸酶(RNAse)、牛胰RNA酶、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白-A、干扰素-α、干扰素-λ、脲酶、鹅膏毒素、α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、bouganin和葡萄球菌肠毒素；其中n为与所述CCD的半胱氨酸残基的数目相等的整数。67.一种靶向缀合物组合物，其中所述靶向缀合物组合物根据式II的结构进行配置：其中a.所述TM为包含VL和VH序列的scFv，其中每个VL和VH与来自选自表19中所示的VL和VH序列的抗体的VL和VH具有至少90％、...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，V·谢尔恩伯杰，丁晟，德西蕾·赛耶，王家威，
申请(专利权)人：阿穆尼克斯运营公司，
类型：发明
国别省市：美国,US