胰高血糖素样肽-2组合物及其制备和使用方法技术

本发明专利技术涉及包含与延伸的重组多肽(XTEN)相连接的GLP‑2蛋白或其变体的组合物，编码该组合物的分离核酸和含有该核酸的载体和宿主细胞，以及制备该组合物和使用该组合物治疗GLP‑2相关病症的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】胰高血糖素样肽-2组合物及其制备和使用方法相关申请的交叉引用本申请要求提交于2011年9月12日的美国临时申请序列号61/573,748的优先权，该申请通过引用整体并入本文。
技术介绍
胰高血糖素样肽-2(GLP-2)是一种内分泌肽，其在人类中是通过胰高血糖素原的翻译后蛋白水解切割而产生的33个氨基酸的肽；这是一个还释放相关胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的过程。GLP-2由肠内分泌L细胞以营养依赖型的方式产生并分泌。GLP-2通过刺激隐窝细胞的增殖和减少肠细胞凋亡而向肠黏膜上皮细胞提供营养。GLP-2通过特异性的GLP-2受体发挥其作用，但在肠道内的响应由间接途径介导，在该间接途径中受体不在上皮上表达而在肠神经元上表达。(Redstone,HA等，TheEffectofGlucagon-LikePeptide-2ReceptorAgonistsonColonicAnastomoticWoundHealing.GastroenterolResPract.(2010)；2010:Art.ID:672453)。GLP-2的作用是多样的，包括导致肠吸收和营养同化增强的肠营养效应(ntestinatrophiceffect)(Lovshin,J.和D.J.Drucker,Synthesis,secretionandbiologicalactionsoftheglucagon-likepeptides.Ped.Diabetes(2000)1(1):49-57)；抗炎活性；粘膜愈合和修复；肠通透性降低；和肠系膜血流量增加(Bremholm,L.等，Glucagon-likepeptide-2increasesmesentericbloodflowinhumans.Scan.J.Gastro.(2009)44(3):314-319)。外源性施用的GLP-2在人类和啮齿类动物中造成了许多影响，包括减缓胃排空、增加肠血流量和肠生长/粘膜表面面积、增强肠功能、减少骨质分解和神经保护作用。GLP-2可能以内分泌的方式发挥作用，使肠生长和代谢与营养摄入相关联。然而，在发炎的粘膜中，GLP-2的作用是抗增殖，在增加IGF-1表达的同时减少促炎细胞因子的表达，促进发炎粘膜的愈合。对于广泛的病症，包括结肠直肠癌、炎性肠病、肠易激综合征和创伤，许多患者需要手术切除小肠或大肠。进行了末端空肠造口术而没有结肠的短肠综合征(SBS)患者，由于去除了分泌L细胞而降低了响应于膳食的GLP-2的释放。患有活动性克罗恩病或溃疡性结肠炎的患者的内源性血清GLP-2浓度升高，提示对粘膜损伤的正常适应性反应的可能性(Buchman,A.L.等，Teduglutide,anovelmucosallyactiveanalogofglucagon-likepeptide-2(GLP-2)forthetreatmentofmoderatetosevereCrohn'sdisease.InflammatoryBowelDiseases,(2010)16:962–973)。外源性施用的GLP-2和GLP-2类似物已被证明在动物模型中促进肠上皮细胞的生长和修复，包括增强啮齿动物中小肠切除后的营养吸收和减轻全肠胃外营养诱发的发育不全，以及证明了动物模型中死亡率减少和疾病相关的组织病理学改善，诸如吲哚美辛诱发型肠炎，硫酸葡聚糖诱发型结肠炎和化疗诱发型粘膜炎。因此，GLP-2和相关类似物可能是用于短肠综合征、肠易激综合征、克罗恩病和其他肠病的治疗(Moor,BA等，GLP-2receptoragonismamelioratesinflammationandgastrointestinalstasisinmurinepost-operativeileus.JPharmacolExpTher.(2010)333(2):574-583)。然而，由于二肽酰肽酶IV(DPP-IV)切割，天然GLP-2的半衰期为大约7分钟(JeppesenPB等，Teduglutide(ALX-0600),adipeptidylpeptidaseIVresistantglucagon-likepeptide2analogue,improvesintestinalfunctioninshortbowelsyndromepatients.Gut.(2005)54(9):1224-1231；HartmannB等，(2000)DipeptidylpeptidaseIVinhibitionenhancestheintestinotrophiceffectofglucagon-likepeptide-2inratsandmice.Endocrinology141:4013–4020)。已经确定了第2位的丙氨酸置换成甘氨酸的GLP-2序列的修饰阻断了由DPP-IV引起的降解，将称为替度鲁肽(teduglutide)类似物的半衰期延长至0.9-2.3小时(MarierJF,PopulationpharmacokineticsofteduglutidefollowingrepeatedsubcutaneousadministrationsinhealthyparticipantsandinpatientswithshortbowelsyndromeandCrohn'sdisease.JClinPharmacol.(2010)50(1):36-49)。然而，在短肠综合征患者中利用替度鲁肽的临床试验要求每天施用GLP-2，以实现临床益处(JeppesenPB,Randomizedplacebo-controlledtrialofteduglutideinreducingparenteralnutritionand/orintravenousfluidrequirementsinpatientswithshortbowelsyndrome.Gut(2011)60(7):902-914)。对治疗蛋白质的化学修饰可以改变其体内清除率和随后的半衰期。常见修饰的一个实例是添加聚乙二醇(PEG)部分，聚乙二醇(PEG)部分通常通过PEG上与胺基(例如赖氨酸侧链或N端)反应的醛或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团而与蛋白质偶联。然而，偶联步骤可导致需要分离的不均一产物混合物的形成，导致明显的产物损失和生产复杂性，并且得不到化学上完全均一的产物。而且，如果其结合位点附近的氨基酸侧链被PEG化过程所修饰，药理学活性蛋白质的药理学功能可能受阻。其他方法包括Fc结构域与治疗性蛋白质的基因融合，这增加了治疗蛋白质的大小，因此降低了通过肾的清除率。此外，Fc结构域赋予结合溶酶体并通过FcRn受体从溶酶体再循环的能力，这导致增加的药代动力学半衰期。融合到Fc的GLP-2的形式已经在与患有术后肠梗阻相关的胃肠炎症的小鼠模型中进行评估(Moor,BA等，GLP-2receptoragonismamelioratesinflammationandgastrointestinalstasisinmurinepost-operativeileus.JPharmacolExpTher.(2010)333(2):574-583)。遗憾的是，Fc结构域未本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组融合蛋白，包含在N端的序列为SEQ ID NO:1的胰高血糖素样蛋白‑2‑2G(GLP‑2‑2G)和在C端的延伸的重组多肽XTEN‑AE864，至少一个甘氨酸残基位于所述GLP‑2‑2G和XTEN‑AE864之间，其中所述XTEN‑AE864的序列与SEQ ID NO:96所示序列显示100％序列同一性，其中所述融合蛋白展现出：(i)至少为4的表观分子量因子；(ii)当使用用于钙通量的体外G蛋白偶联受体GLP2实验进行分析时，效力为未连接至XTEN‑AE864的相应GLP‑2‑2G的2％；以及(iii)当采用与未连接至XTEN‑AE864的相应GLP‑2‑2G相比少2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍的以nmol/kg计的量向受试者施用时，与未连接至XTEN‑AE864的相应GLP‑2‑2G可比的肠营养效应。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.12 US 61/573,7481.一种重组融合蛋白，包含在N端的序列为SEQIDNO:1的胰高血糖素样蛋白-2-2G(GLP-2-2G)和在C端的延伸的重组多肽XTEN-AE864，至少一个甘氨酸残基位于所述GLP-2-2G和XTEN-AE864之间，其中所述XTEN-AE864的序列与SEQIDNO:96所示序列显示100％序列同一性，其中所述融合蛋白展现出：(i)至少为4的表观分子量因子；(ii)当使用用于钙通量的体外G蛋白偶联受体GLP2实验进行分析时，效力为未连接至XTEN-AE864的相应GLP-2-2G的2％；以及(iii)当采用与未连接至XTEN-AE864的相应GLP-2-2G相比少2倍、或3倍、或4倍、或5倍、或6倍的以nmol/kg计的量向受试者施用时，与未连接至XTEN-AE864的相应GLP-2-2G可比的肠营养效应。2.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述肠内营养效应与未与XTEN-AE864相连接的相应GLP-2-2G当采用可比剂量向受试者施用相应GLP-2-2G时相比，是其肠营养效应的100％以上。3.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述受试者选自小鼠、大鼠、猴和人。4.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其中所述施用是皮下、肌肉内或静脉内施用。5.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其中在施用1剂、或3剂、或6剂、或10剂、或12剂或更多剂的所述融合蛋白后确定所述肠营养效应。6.如权利要求1所述的重组融...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·谢尔恩伯杰，J·西尔弗曼，W·P·施泰姆尔，王家威，N·吉西格，B·斯平克，
申请(专利权)人：阿穆尼克斯运营公司，
类型：发明
国别省市：美国,US