本发明专利技术公布了一种微生物发酵法合成罗汉果醇代谢路径中三萜类化合物，即含有葫芦烷二烯醇合成酶SgCbQ、P450 CYP87D18和细胞色素还原酶CPR的酿酒酵母重组菌株SY2，以葡萄糖为底物合成11-氧-葫芦烷二烯醇、11-羟基-葫芦烷二烯醇、11-氧-24,25-环氧-葫芦烷二烯醇三种新产物。本发明专利技术还提出由葫芦烷二烯醇合成罗汉果醇的代谢途径，即葫芦烷二烯醇经P450 CYP87D18催化合成11-氧-葫芦烷二烯醇，后者经该酶催化合成11-羟基-葫芦烷二烯醇和11-氧-24,25-环氧-葫芦烷二烯醇，这两种产物可经其他P450或环氧化物酶合成罗汉果醇。本发明专利技术还提出了糖基转移酶催化新产物获得更多糖基化产物的新思路。因此，本发明专利技术对于确定罗汉果醇合成途径，微生物发酵法合成相关中间代谢产物及糖基化产物具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及罗汉果醇合成路径中三种萜类化合物及其糖基化产物的合成方法。即运用含有葫芦烷二烯醇合成酶和细胞色素P450的重组酿酒酵母菌株，以葡萄糖为底物合成三种萜类化合物，这三种萜类化合物经质谱和核磁鉴定分别为11-羟基-葫芦烷二烯醇，11-氧-葫芦烷二烯醇，11-氧-24,25-环氧-葫芦烷二烯醇；这三种萜类化合物进一步经糖基化合成多种糖基化产物。
技术介绍
罗汉果(Siraitiagrosvenorii)是我国所特有的珍贵药用植物，主要分布于我国广西地区，具有止咳润肺、化痰补血、润肠通便、祛瘀等功能（IndraPrakashandVenkataSaiPrakashChaturvedula.AdditionalnewminorcucurbitaneglycosidesfromSiraitiagrosvenorii.Molecules.2014.19:3669-3680），已被卫生部和中医药管理局列入第一批“药食同源品种名单”。罗汉果提取物主要成分为罗汉果甜甙，是一种高甜度、低能量的天然甜味剂，同时具有降血糖、抗氧化、抗癌、抗病毒等作用可广泛应用于营养保健品、食品、药品等行业中(Chun-HuiChiu,ReubenWang,Cho-ChingLee,Yi-ChenLo,Ting-JangLu.BiotransformationofmogrosidesfromSiraitiagrosvenoriiSwinglebySaccharomycescerevisiae.Journalofagriculturalandfoodchemistry.2013.61:7127-7134)。在罗汉果甜甙中，四种三萜类化合物含量较多，分别为罗汉果甙V，罗汉果甙Ⅵ，赛门甙I，11-氧-罗汉果甙；此外，还有一些三萜类化合物具有很重要的功能。目前罗汉果甜甙主要从罗汉果中提取，受种植条件和低提取率的影响，罗汉果甜甙远未达到市场需求。随着代谢工程和合成生物学技术的发展，微生物发酵法合成萜类化合物已被广泛研究，一些化合物如青蒿素，紫杉醇已经可以通过微生物发酵方式规模化合成。针对罗汉果甜甙的生物合成路径，已有文献报道葫芦烷二烯醇合成酶催化三萜骨架2,3氧化角鲨烯合成葫芦烷二烯醇，后者经三步P450氧化获得罗汉果醇，进一步经C-3和C-24糖基化得到罗汉果甜甙(QiTang,XiaojunMa,ChangmingMo,IainWWilson,CaiSong,HuanZhao,YanfangYang,WeiFu,DeyouQiu.AnefficientapproachtofindingSiraitiagrosvenoriitriterpenebiosyntheticgenesbyRNA-seqanddigitalgeneexpressionanalysis.BMCGenomics2011.12:343）。目前经2,3-氧化角鲨烯合成葫芦烷二烯醇和经罗汉果醇糖基化合成罗汉果甜甙这两部分合成路径已比较清晰，相关酶已有报道，例如采用来源于拟南芥的糖基转移酶催化罗汉果醇合成罗汉果甜甙I（DaiL,LiuC,ZhuY,etal.FunctionalcharacterizationofcucurbitadienolsynthaseandtriterpeneglycosyltransferaseinvolvedinbiosynthesisofmogrosidesfromSiraitiagrosvenorii.PlantandCellPhysiology.2015.YaoquanLiu,JungYeopLee,MonikaKhare.Methodsandmaterialsforenzymaticsynthesisofmogrosidecompounds.US20140308698A1.）；但是催化葫芦烷二烯醇合成罗汉果醇的细胞色素P450报道很少，比较结构发现，葫芦烷二烯醇需要经C-11羟基化或者氧化，C-24和C-25羟基化才能得到罗汉果醇，有报道提出了葫芦烷二烯醇合成罗汉果醇可能的合成路线，但并未进行准确验证（YaoquanLiu,JorgenHansen,JensHoughton-larsen,MuthuswamyPanchapagesaMurali,SathishKumar,NinaNicolineRasmussen.Methodsandmaterialsforbiosynthesisofmogrosidecompounds.US20150064743A1）。葫芦烷二烯醇经P450单氧化酶催化C-11羟基化后生成C-11-羟基-葫芦烷二烯醇，如此该化合物可经糖基化酶修饰获得C-3或者C-11糖基化产物。以此类推，葫芦烷二烯醇催化获得罗汉果醇过程中，理论上所产生的羟基均可能经糖基化合成新的产物。因此探究和确定葫芦烷二烯醇合成罗汉果醇路径中的中间代谢产物，并对其糖基化获得新的产物是本专利技术的一个中心思路。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供由葫芦烷二烯醇合成罗汉果醇路径中三种三萜类化合物的合成方法。具体是将来源于Siraitiagrosvenorii的细胞色素P450基因CYP87D18、葫芦烷二烯醇合成酶CbQ和来源于Arabidopsisthaliana的细胞色素还原酶（CPR）酶基因引入酿酒酵母BY4741中，获得重组酿酒酵母菌株SY2；所得重组菌株SY2以葡萄糖为底物合成三种三萜类化合物，这三种化合物经质谱和核磁验证确定为11-氧-葫芦烷二烯醇、11-羟基-葫芦烷二烯醇、11-氧-24,25-环氧-葫芦烷二烯醇。本专利技术的目的之二是提出了由葫芦烷二烯醇合成罗汉果醇的代谢途径。具体是葫芦烷二烯醇经细胞色素P450CYP87D18催化首先合成11-氧-葫芦烷二烯醇，后者经P450酶CYP87D18进一步催化合成11-羟基-葫芦烷二烯醇和11-氧-24,25-环氧-葫芦烷二烯醇，11-羟基-葫芦烷二烯醇可经Siraitiagrosvenorii中其他种类的P450氧化酶催化在C-24和C-25分别羟化合成罗汉果醇；11-氧-24,25-环氧-葫芦烷二烯醇可经Siraitiagrosvenorii中其他种类的环氧化物酶（Epoxidehydrolase）合成罗汉果醇。该合成路径的提出对于准确确定葫芦烷二烯醇合成罗汉果醇合成路径以及微生物发酵方法合成相关中间产物具有重要意义。本专利技术的目的之三是提出三萜类化合物11-氧-葫芦烷二烯醇、11-羟基-葫芦烷二烯醇、11-氧-24,25-环氧-葫芦烷二烯醇经糖基转移酶催化合成新产物的思路。具体包括下面几个方面：首先，经重组酿酒酵母菌株SY2发酵得到的三萜类产物11-羟基-葫芦烷二烯醇可以经糖基转移酶催化获得C-3糖基化，C-11糖基化，或C-3和C-11同时糖基化的产物，糖基化的葡萄糖可以是一个或者多个，如图1所示。其次，经重组酿酒酵母菌株SY2发酵得到的三萜类产物11-氧-葫芦烷二烯醇可以经糖基转移酶催化获得C-3糖基化产物，糖基化的葡萄糖可以是一个或者多个，如图1所示。再次，经重组酿酒酵母菌株SY2发酵得到的三萜类产物11-氧-24,25-环氧-葫芦烷二烯醇可以经糖基转移酶催化获本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种发酵法合成11‑氧‑葫芦烷二烯醇、11‑羟基‑葫芦烷二烯醇、11‑氧‑24,25‑环氧‑葫芦烷二烯醇的方法。
【技术特征摘要】
1.一种发酵法合成11-氧-葫芦烷二烯醇、11-羟基-葫芦烷二烯醇、11-氧-24,25-环氧-葫芦烷二烯醇的方法。2.其特征在于，含有葫芦烷二烯醇合成酶SgCbQ、细胞色素P450CYP87D18和细胞色素还原酶CPR的酿酒酵母重组菌株SY2，可以以葡萄糖为底物发酵合成三种三萜类化合物，这三种化合物经质谱和核磁验证分别为11-氧-葫芦烷二烯醇、11-羟基-葫芦烷二烯醇、11-氧-24,25-环氧-葫芦烷二烯醇。3.权利要求1所得到的11-氧-葫芦烷二烯醇可经糖基转移酶催化获得C-3位糖基化产物，糖基化的葡萄糖可以是一个或者多个。4.权利要求1所得到的11-羟基-葫芦烷二烯醇可以经糖基转移酶催化获得C-3位糖基化、C-11位糖基化、或C-3和C-11位同时糖基化的新产物，糖基化的葡萄糖可以是一个...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨建刚，张江生，戴隆海，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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