一种洛美沙星免疫原及其制备方法和检测试纸卡技术

本发明专利技术提供的一种洛美沙星免疫原，具有式I所示结构。本发明专利技术提供的一种洛美沙星免疫原的制备方法，洛美沙星上羧基进行C链衍生化，同时BSA使用糖基化修饰法进行活化，再利用碳二亚胺两步法合成免疫，制备出的免疫原具有偶联率高、免疫性强的特点。本发明专利技术还提供的一种检测洛美沙星用试纸卡，具有检测速度快，灵敏度高，所述试纸卡的检测限可达0.3ng/ml，同时满足快速检测的要求。

Lomefloxacin immunogen and its preparation method and test paper card

The present invention provides lomefloxacin immunogen, which has the structure shown in formula I. A lomefloxacin immunogen for the preparation method of the invention, lomefloxacin carboxyl C chain derivatization, and BSA glycosylation method for activation and reuse of carbon two imine two step synthesis of immune, immune prepared with the original coupling rate is high, strong immunity characteristics. The invention also provides a test paper card for the detection of Lomefloxacin, which has the advantages of fast detection speed and high sensitivity, and the detection limit of the test paper card can reach 0.3ng/ml, and meets the requirements of rapid detection.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药和医学检验
，尤其涉及一种一种洛美沙星免疫原及其制备方法和检测试纸卡。
技术介绍
洛美沙星(LOM)是一种新型长效氟喹诺酮类抗菌药物，其化学名称为1-乙基-6,8-二氟-1,4-二氢-7-(3-甲基-1-哌嗪基)-4-氧代-3-喹啉羧酸盐酸盐。氟喹诺酮类药物对多种革兰阳性菌和革兰阴性菌均有较强的抗菌作用，因此在畜牧、水产业中被广泛应用于治疗和预防细菌感染，并作为饲料添加剂促进动物的生长。但是长期食用被此类药物污染的食品，人类会产生耐药性和抗药性，严重时会引起神经中毒、肾功能衰竭及潜在的致癌性等毒副作用。因此，中国、美国、欧盟、联合国粮农组织、世界卫生组织食品添加剂专家委员会等国家或组织都制定了此类药物的最高残留限量。洛美沙星药物残留检测的传统方法有微生物学法，高效液相色谱法(HPLC)，液质联用法(LC-MS)和液相色谱－串联质谱法(LC-MS/MS)等方法。这些方法灵敏度高、特异性强，但样品前处理繁琐，需要专业的技术人员和昂贵的仪器设备，不适合大批量的市场监测要求。免疫学检测方法建立在抗体对抗原的分子识别上，具有抗原抗体的亲合力高、检测快速、经济实用，能够实现对生物液体的小体积、大通量检测的优点。但是根据现有技术中，杜付彬等人报道洛美沙星人工抗原的合成及鉴定方法，具体采用碳二亚胺法和混合酸酐法合成洛美沙星免疫原和包被原，但是制备的洛美沙星免疫原并未免疫小鼠，因此，无法估算单克隆抗体的特异性；再如，公告号为CN100418982C的专利公开了一种洛美沙星的偶联物及其制备方法，采用碳二亚胺法制备的洛美沙星的偶联物免疫白兔，抗血清的最低检测限为1ppb(1μg/L)。因此，现有技术需要更低的检测限的洛美沙星检测试剂盒。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于一种洛美沙星免疫原及其制备方法，使制备得到的洛美沙星免疫原具有较高的免疫性和偶联率高，用所述免疫原免疫动物时得到具有特异性强、灵敏度高的洛美沙星单克隆抗体单克隆抗体。本专利技术另一个目的是提供一种洛美沙星检测试纸卡，使所述试纸卡具有检测速度快、灵敏度高、结果准确的特点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种洛美沙星免疫原，具有式I所示结构：本专利技术还提供一种洛美沙星免疫原的制备方法，括以下步骤：1)将氨基戊酸和洛美沙星在缓冲液中进行脱水缩合反应，将得到的反应液萃取，再进行反萃取，得到碳链延伸的LOM半抗原；2)将所述步骤1)得到的碳链延伸的LOM半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺按，得到碳链延伸的LOM半抗原溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与所述碳链延伸的LOM半抗原溶液混合，避光条件进行置换反应，得到活化的LOM半抗原；3)将牛血清白蛋白、葡萄糖和磷酸缓冲液混合，调节混合液的pH值至9.0～10，在振荡条件下反应，得到活化的cBSA；4)将所述步骤1)中得到的活化的cBSA溶解于含有N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲溶液中，得到cBSA溶液；5)将所述步骤2)得到的活化的LOM半抗原滴加到所述步骤4)得到的cBSA溶液中，在振荡条件下反应，得到具有式I所示结构的洛美沙星-牛血清白蛋白免疫原：所述步骤1)～2)与步骤3)之间没有时间顺序的限制。优选的，所述步骤1)中氨基戊酸溶液的pH值为10.0～12.0；所述氨基戊酸溶液的质量浓度为20～40mg/ml。优选的，所述步骤1)中洛美沙星溶液的质量浓度为18～36mg/ml；所述洛美沙星溶液的溶剂为摩尔浓度为0.01～0.02mol/L，pH值为7.0～7.5的PBS溶液。优选的，所述步骤1)中萃取用溶剂为乙酸乙酯；所述洗涤用洗涤液为质量浓度为0.09～0.18mg/ml的盐酸溶液；所述反萃取用反萃剂为质量浓度为2.1～4.2mg/ml的碳酸氢钠溶液。优选的，所述步骤3)中振荡的转速为50～200r/min，所述步骤3)中反应的温度为30～37℃。优选的，所述步骤5)中振荡的转速为50～200r/min；所述振荡的温度为30～37℃。本专利技术还提供了一种检测洛美沙星用试纸卡，包括卡壳，底板，样品垫，金标垫，反应区和吸水区，所述反应区设有检测线T和质控线C，其特征在于，所述检测线T位置包被有洛美沙星包被原，所述质控线C位置包被有兔抗IgG，所述金标垫附着有金标记的洛美沙星单克隆抗体；所述金标记的洛美沙星单克隆抗体是由权利要求1所述的洛美沙星-牛血清白蛋白免疫原免疫小鼠得到的细胞株分泌产生。优选的，所述洛美沙星包被原的包被浓度为0.1～0.2μg/ml。优选的，所述金标垫附着有金标记的洛美沙星单克隆抗体的质量浓度为0.1～0.2mg/ml。本专利技术提供的一种洛美沙星-牛血清白蛋白免疫原，具有式I所示结构。所述的洛美沙星免疫原在洛美沙星的羧基上进行C链衍生化，使羧基伸长，使抗原决定簇暴露在外，制成的免疫原具有较强的免疫性。本专利技术提供的一种洛美沙星免疫原的制备方法，洛美沙星上羧基进行C链衍生化，同时BSA使用糖基化修饰法进行活化，再利用碳二亚胺两步法合成免疫，制备出的免疫原具有偶联率高、免疫性强的特点。本专利技术提供的单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的单克隆抗体。本专利技术提供的一种检测洛美沙星用试纸卡，包括卡壳，底板，样品垫，金标垫，检测区和吸水区，所述检测区设有检测线T和质控线C，所述检测线T位置包被有洛美沙星包被原，所述质控线C位置包被有兔抗IgG，所述金标垫附着有金标记的洛美沙星单克隆抗体；所述金标记的洛美沙星单克隆抗体是由权利要求1所述的洛美沙星-牛血清白蛋白免疫原免疫小鼠得到的细胞株分泌产生。本专利技术将上述制备得到的洛美沙星单克隆抗体与洛美沙星包被原制备成的试纸卡，具有检测速度快，灵敏度高，且满足快速检测的要求，所述试纸卡的检测限可达0.3ng/ml。进一步的，卡壳的使用可以延长检测结果观察时间，试纸卡稳定性好。本试纸卡样品吸收垫将检测溶液完全吸收，使之与偶联垫上金标抗体充分反应，可以有效减少误差率；还可以防止外界杂质干扰，影响金标抗体与检测抗原的结合；成本低、投资少。使用本专利技术试纸卡，不需要另配复杂的仪器设备和昂贵的试剂，现场检测一步到位，成本低廉，见效快；易于大范围推广应用。本试纸卡操作简单，适合不同类别的人员使用，如实验室检测、海关检疫、卫生监督、规模养殖及个体生产等，具有广阔的市场前景和较大的经济效益和社会效益。附图说明图1为实施例1中洛美沙星免疫原合成反应合成路线图；图2为实施例3中洛美沙星检测抗原合成路线图；图3为实施例5中洛美沙星特异性免疫学检测试纸卡的结构示意图；图4为实施例5中洛美沙星特异性免疫学检测试纸卡中试纸条的侧视图；图5为实施例5中洛美沙星特异性免疫学检测试纸卡中试纸条的俯视图。具体实施方式本专利技术提供了一种洛美沙星免疫原，具有式I所示结构：本专利技术还提供一种洛美沙星免疫原的制备方法，包括以下步骤：1)将氨基戊酸溶液和洛美沙星溶液进行脱水缩合反应，将得到的反应液萃取，再进行反萃取，得到碳链延伸的LOM半抗原；2)将所述步骤1)得到的碳链延伸的LOM半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺按，得到碳链延伸的LOM半抗原溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种洛美沙星‑牛血清白蛋白免疫原，具有式I所示结构：

【技术特征摘要】
1.一种洛美沙星-牛血清白蛋白免疫原，具有式I所示结构：2.一种洛美沙星免疫原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将氨基戊酸和洛美沙星在缓冲溶液体系中进行脱水缩合反应，将得到的反应液依次进行萃取和反萃取，得到碳链延伸的LOM半抗原；2)将所述步骤1)得到的碳链延伸的LOM半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺按，得到碳链延伸的LOM半抗原溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与所述碳链延伸的LOM半抗原溶液混合，避光反应，得到活化的LOM半抗原；3)将牛血清白蛋白、葡萄糖和磷酸缓冲液混合，调节混合液的pH值至9.0～10，在振荡条件下反应，得到活化的cBSA；4)将所述步骤3)中得到的活化的cBSA溶解于含有N,N-二甲基甲酰胺的磷酸盐缓冲溶液中，得到cBSA溶液；5)将所述步骤2)得到的活化的LOM半抗原滴加到所述步骤4)得到的cBSA溶液中，在振荡条件下反应，得到具有式I所示结构的洛美沙星-牛血清白蛋白免疫原：所述步骤1)～2)与步骤3)之间没有时间顺序的限制。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中氨基戊酸溶液的pH值为10.0～12.0；所述氨基戊酸溶液的质量浓度为20～40mg/ml。4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中洛美沙星溶液的质量浓度为18～...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜金庆，刘长忠，赵坤，杨雪峰，王自良，范国英，胡建和，雷壮，牛琳琳，王靖文，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：河南;41