相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法技术

本发明专利技术提供了一种无同位素标记相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法，包括：将蛋白质酶解成肽段，利用不依赖母离子的串级质谱方法方法确定具有磷酸化位点的肽段，以及利用无标记定量方法对具有磷酸化位点的肽段进行相对定量分析。相对于现有的依赖母离子的串级质谱分析与稳定同位素标记技术相结合的方法，该方法不需要同位素标记试剂，因此具有降低实验成本操作复杂程度的优势。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种分析方法，具体而言，本专利技术涉及一种。
技术介绍
随着2000年6月国际人类基因组计划的完成，人类开始从基因组时代步入后基因组时代，在后基因组时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，基因的功能是靠其功能的执行者-蛋白质来实施的，因而对蛋白质的表达量、定位、修饰状态以及蛋白质之间相互作用的研究成为后基因组时代的热点研究领域。在生命体内，蛋白质在发挥功能之前需要经过基因的转录、翻译、翻译后修饰过程，并转运到细胞或组织内特定的部位发挥功能。大多数蛋白质在发生翻译后修饰之前是没有活性的，也就是说，蛋白质的翻译后修饰对于执行蛋白质特定的功能是极其重要的，它使特定蛋白质的结构更加复杂、功能更加完备、调控机制也更加精细。目前在真核细胞中存在20多种翻译后修饰的形式，比较常见的有磷酸化修饰、糖基化修饰、乙酰化修饰、甲基化修饰等。磷酸化修饰是一种广泛存在于生命体内的蛋白质翻译后修饰，细胞内许多具有关键功能的蛋白质都会发生磷酸化修饰，它参与和调控生物体内的许多生命活动。在真核细胞内，磷酸化修饰主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等氨基酸残基上，人类蛋白质组中含有10万多个潜在的磷酸化位点，并且以不同磷酸化形式的混合物存在，对细胞内的各种活性调控均发挥着重要的作用。随着蛋白质组学的飞速发展，对蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。由于磷酸化蛋白质是各种磷酸化形式的复合物，而且是动态变化的，对磷酸化蛋白质组的定量研究突显出尤为重要的意义。目前，采用相对定量蛋白质磷酸化修饰的方法来表征蛋白质磷酸化水平的变化，一直以来，蛋白质组学面临的一个重要任务就是不同样本中蛋白质的相对定量问题。具体而言，相对定量蛋白质磷酸化修饰方法是一种比较不同条件下蛋白质各个修饰位点上磷酸化水平的相对差异的方法。定量分析的前提是检测蛋白质的磷酸化，所依赖的常规技术是32P放射性同位素标记法和磷酸化抗体的免疫印迹技术。检测磷酸化蛋白最经典的生化方法是32P放射性标记法，可以对活体细胞或者纯化好的蛋白质进行标记。以标记活细胞为例，具体过程为:培养待标记的细胞至适当的生长期，在生长旺盛的细胞中磷酸盐的转运达到最高峰，此时用不含磷酸盐标记的培养液(如DMEM)替换原来的细胞培养液，并加入32P标记的磷酸盐共培养，使细胞ATP库与32P平衡，蛋白激酶利用被放射性标记的ATP使底物磷酸化，而后裂解细胞提取蛋白质，随后进行凝胶电泳分离蛋白质混合物，使用32P的放射自显影信号检测磷酸化蛋白质。磷酸化抗体的免疫印迹技术是使用抗磷酸化蛋白的抗体特异性得识别电泳凝胶上的蛋白条带，并通过显色反应来检测与抗体结合的磷酸化蛋白。目前，抗酪氨酸磷酸化与抗丝氨酸/苏氨酸磷酸化的抗体(广谱性抗体)是应用较广泛的抗体，理论上它们能够识别和结合多种蛋白质上带磷酸根的特定氨基酸残基。对于组成非常复杂的蛋白质组样品(例如全细胞的蛋白提取液)，通常先使用针对目标蛋白质的抗体首先对该蛋白进行免疫沉淀，而后使用抗磷酸化蛋白的抗体检测目标蛋白上的磷酸化信号。某些情况下，也可使用针对特定蛋白质磷酸化基团制作的抗体来检测该蛋白的磷酸化信号。磷酸化抗体产生的信号的强弱反映出目标蛋白质的磷酸化水平的高低。但32P放射性同位素标记法和磷酸化抗体的免疫印迹技术多数情况下只能检测蛋白质整体的磷酸化水平，无法分辨修饰的位点，也就难以对每个位点的修饰水平加以定量。磷酸化抗体的免疫印迹技术的缺点如下:首先，检测蛋白质磷酸化的广谱性抗体的选择性很低，无法区分是何种蛋白质带有修饰，因此只能用于检测纯化或富集后的单一蛋白质的磷酸化，难以直接分析组成复杂的蛋白质混合物；其次，广谱性的抗体检测的是蛋白质整体的磷酸化水平，难以辨别不同位点的修饰差异，再次，这类广谱性的抗体亲和力也较弱，导致磷酸化比例低的蛋白无法被检测到。因此，免疫印迹只可用于半定量分析，定量的准确性和动态范围都很有限。32P放射性同位素标记法的大部分缺点与免疫印迹是重合的，例如选择性低，无法检测蛋白质上不同位点的磷酸化水平，定量的准确性和动态范围都有限等。另外，放射自显影的实验需要使用专门的防辐射设备，使得实验成本大幅度增加，操作的复杂性增高。其次，对某些磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质，只能渗入少量的放射性磷酸盐，有可能检测不到。最后，不同蛋白质上的氨基酸其磷酸化和去磷酸化的代谢速率有差异，所以掺入32P磷酸盐的速率也是不一样的，从而给定量比较引入误差。目前用于鉴定蛋白质磷酸化的最有效的技术是质谱方法，该方法通常采用依赖母离子的串级质谱分析(data-dependent MS/MS)对蛋白质的酶解片段进行序列解析并鉴定带有修饰的氨基酸残基。将该方法与稳定同位素标记技术(isotope-labeling)相结合即可对不同条件下的蛋白质组的定量变化进行精细的分析(Michela Tomaiuoloa, GennaroVecchione.Stable-1sotopedilution LC-ES1-MS/MS techniques for the quantitativeof total homocysteinein human plasma.Journal of Chromatography B 2009，3292-3299.)。目前，在以液相色谱-质谱串联系统为基础的技术流程中，最常用的定量技术是采用稳定同位素标记的方法使两个样本中的同一蛋白质分别带上不同的质量标签，利用该质量标签在质谱分析中产生的不同信号的强度差异，可以研究多个样本中的特定蛋白质的相对定量变化。但是这种同位素标记的定量的质谱方法需要消耗较大量的标记试剂，造成实验成本和操作的复杂程度均明显上升。
技术实现思路
现有技术中，使用同位素标记的定量方法需要消耗较大量的标记试剂，造成实验成本和操作的复杂程度均明显上升，为了解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供了一种无同位素标记，该方法包括:将蛋白质酶解成肽段，利用不依赖母离子的串级质谱技术确定具有磷酸化位点的肽段，以及利用无标记定量方法对具有磷酸化位点的肽段进行相对定量分析。由于直接从蛋白质的酶解肽段中鉴定磷酸化肽段并确定其位点具有很高的难度，这是因为:第一，磷酸化蛋白质含量一般很低，化学计量值低，磷酸化的肽段很容易淹没在大量非磷酸化的肽段中；其次，磷酸化的肽段本身所具有的负电性使其在正离子模式的质谱分析中信号受到抑制；再次，磷酸化基团在串级质谱分析中容易从肽链上断裂，这使得发现磷酸化位点遇到很高的挑战。为此，本专利技术对蛋白质酶解产物中的磷酸化肽段首先进行高效的富集，去除那些非磷酸化的肽段。因此，在上述无同位素标记相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平方法中，在将蛋白质酶解成肽段的步骤和利用data-1ndependent MS/MS方法确定具有磷酸化位点的肽段的步骤之间还包括富集磷酸化肽段的步骤。本专利技术采用以二氧化钛或金属铁/金属锆氧化物为基质制作的亲和纯化柱对磷酸化肽段进行富集。首先将待分析的蛋白质样品酶解，使之转化为肽段的混合物。该肽段样品直接上样到亲和柱上，其中含有的磷酸化肽段会被基质特异性地吸附，而大部分的非磷酸化肽段则不被保留而流出。为了彻底去除非特异性肽段的吸附，还需要用含有2，5_ 二羟基苯甲酸或谷氨酸的溶液多次润洗柱子，最后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无同位素标记相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法，包括：将蛋白质酶解成肽段，利用不依赖母离子的串级质谱方法确定具有磷酸化位点的肽段，以及利用无标记定量方法对具有磷酸化位点的肽段进行相对定量分析。

【技术特征摘要】
1.一种无同位素标记相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法，包括:将蛋白质酶解成肽段，利用不依赖母离子的串级质谱方法确定具有磷酸化位点的肽段，以及利用无标记定量方法对具有磷酸化位点的肽段进行相对定量分析。2.根据权利要求1所述的方法，其中在将蛋白质酶解成肽段的步骤和利用不依赖母离子的串级质谱方法确定具有磷酸化位点的肽段的步骤之间还包括富集磷酸化肽段的步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述富集磷酸化肽段的步骤包括:利用亲和纯化柱吸附肽段中的磷酸化肽段；从亲和纯化柱洗脱磷酸化肽段；以及收集洗脱的磷酸化肽段。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述亲和纯化柱的基质为二氧化钛或金属铁...

【专利技术属性】
技术研发人员：水雯菁，杨诚，刘丹，魏晓超，徐金华，
申请(专利权)人：天津市国际生物医药联合研究院，南开大学生命科学学院，
类型：发明
国别省市：